The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.
Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.
פריונים הן מחלות ניווניות קשות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מחלות פריון לנבוע misfolding של חלבון הפריון הסלולרי הרגיל, PRP C, על ידי האיזומר זיהומיות בשם PRP מיל. מחלות אלו משפיעים מגוון רחב של מינים, כולל ספגת המוח בפרות, scrapie בכבשים, חולה במחלה ממארת כרונית cervids, ואת מחלת קרויצפלד-יעקב בבני אדם 1-3. פריונים לגרום ניוון מוחיה שמתחיל עם אובדן הסינפטי, ומתקדם כדי vacuolization, דבק, איבוד עצבי, ופיקדונות פלאק. בסופו של דבר, מה שגרם למותם של בעלי החיים / 4 פרט. במשך עשרות שנים, חוקרים חקרו תרכובות אמורות להאט או לעצור את התקדמות מחלת פריון. עם זאת, חוקרים לא מצאו או טיפול מוצלח או רכב משלוח מערכתי אפקטיבי.
ביטוי PRP C אנדוגני נדרש לפיתוח מחלות הפריון 5 </sעד>. לכן, הפחתה או ביטול ביטוי PRP C עלול לגרום עיכוב או שיפור של מחלה. מספר קבוצות יצרו עכברים טרנסגניים עם רמות נמוכות של PRP C או lentivectors מוזרק המבטא shRNA ישירות לתוך רקמת המוח בעכברים לחקור את התפקיד של רמות הביטוי PRP C במחלת הפריון. חוקרים אלה מצאו הפחתת כמות העצבית PRP C הביא לעצירת בנוירופתולוגיה מתקדמת של מחלות הפריון והאריך את החיים של בעלי החיים 6-9. אנחנו דיווחנו על תוצאות טיפול PRP C siRNA בסילוק של PRP מיל בתאי נוירובלסטומה עכבר 10. מחקרים אלה מראים כי השימוש של טיפולים כדי להפחית את רמות ביטוי PRP C, כמו RNA התערבות הקטן (siRNA), אשר מסלק mRNA, אולי מספיק לעכב את התקדמות מחלות פריון. עם זאת, רוב הטיפולים נחקר למחלות הפריון נמסרו בדרכים לא יהיה מעשיבמסגרת רפואית. לכן, טיפול siRNA צריך מערכת משלוח מערכתית, אשר מועברת דרך וריד וממוקד אל מערכת העצבים המרכזי.
החוקרים חקרו את השימוש ליפוזומים כרכב משלוח למוצרי ריפוי גנטי. שומני קטיוני anionic הוא משמשים ההיווצרות של ליפוזומים. שומני קטיוני משמשים באופן נרחב יותר מאשר שומני anionic כי הבדל התשלום בין שומני קטיוני ה- DNA / RNA מאפשר אריזה יעילה. יתרון נוסף של שומני קטיוני הוא שהם לחצות את קרום התא בקלות רבה יותר מאשר שומנים אחרים 11-14. עם זאת, שומנים קטיוני יותר immunogenic מאשר שומנים anionic 13,14. לכן, החוקרים החלו המעבר משימוש קטיוני כדי anionic שומנים ליפוזומים. ג'ין מוצרי טיפול ניתן לארוז ביעילות לתוך ליפוזומים anionic באמצעות סולפט protamine פפטיד בעלי מטען חשמלי חיובי, אשר מתעבה מולקולות DNA / RNA 15-19. מאז lipi anionicds פחות immunogenic מאשר שומנים קטיוני הם עשויים גדלו פעמים במחזור, ועלול להיות נסבל יותר במודלים של בעלי חיים 13,14. ליפוזומים ממוקדים רקמות ספציפיות באמצעות מיקוד פפטידים מחוברים אל ליפוזומים. ונוירופפטידים RVG-9R, אשר נקשר לקולטנים אצטילכולין ניקוטינית, נעשה שימוש כדי למקד siRNA ו ליפוזומים אל CNS 17-20.
דו"ח זה מתאר פרוטוקול לייצר שלושה כלי רכב משלוח siRNA, וכדי לארוז ולספק את siRNA לתאי נוירונים (איור 1). Liposome-siRNA-פפטיד מתחמי (LSPCs) מורכבים ליפוזומים עם siRNA ואת RVG-9R מיקוד פפטיד אלקטרוסטטי מחובר אל פני השטח החיצוני של liposome. פפטיד התייחס ליפוזום כמוס siRNA (PALETS) טיפוליות מורכבות siRNA ו protamine כמוס בתוך liposome, עם ערובה RVG-9R קוולנטית לקבוצות PEG השומנים. באמצעות השיטות הבאות כדי ליצור LSPCs ו PaletS, PRP C siRNA פוחתת ביטוי PRP C עד 90% ב תאים עצביים, אשר טומן בחובו הבטחה עצומה לרפא או מהותית לעכב את התחלתה של פתולוגיה מחלת הפריון.
דו"ח זה מתאר פרוטוקול ליצור שתי מערכות אספקת ממוקדות שמעבירה siRNA ביעילות אל מערכת העצבים המרכזית. שיטות קודמות של אספקת siRNA אל מערכת העצבים המרכזיים כללו הזרקת וקטורי siRNA / shRNA ישירות לתוך המוח, הזרקה תוך ורידית של siRNA הממוקד, או הזרקה תוך ורידית של מתחמים ליפוזום-siRNA ?…
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.
DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
N2 Gas | AirGas | ||
Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
1.0, 0.4, and 0.2um filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
40um Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary – PRC |