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Médecine

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

Published: February 01, 2018
doi:
10.3791/54107
, ,
1Institute for Basic Biomedical Sciences,Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences,Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー アナスタシスは生きている動物を受ける細胞のプロトコルについて述べる。

Abstract

アナスタシスは (ギリシャ語の生活に””ライジング) という本質的に取り返しのつかないことに一般に見なされる後期細胞死のプロセスを逆転できる死ぬセルが最近発見された細胞回復現象であります。アナスタシスを促進が保持または原則レスキューけが細胞心筋細胞や神経細胞、これにより組織の回復を促進するなど交換しにくい。逆に、抗癌治療後アポトーシスを受けるアナスタシスは癌細胞を抑制することで、癌細胞の死をことを確認可能性があり、再発の可能性を減らします。ただし、これらの研究は、生きている動物のアナスタシスを受ける細胞の運命を追跡するためのツールの欠如によって妨げられています。課題は、回復後の形態学的正常な外観にもかかわらず細胞死のプロセスを逆転させた細胞を識別することです。この困難を克服するため、ショウジョウバエおよび哺乳類の CaspaseTracker バイオ センサー システムを識別および anastatic 細胞体外か体内を永久に追跡することができますを開発しました。生成と検出および細胞死の刺激に対する一時的な暴露後アナスタシスはキイロショウジョウバエを追跡する CaspaseTracker デュアル センサー システムの使用のため生体内でプロトコルを紹介します。一方、従来のバイオ センサー、プロトコル積極的に受けてアポトーシス細胞死細胞をラベルすることができます、CaspaseTracker バイオ センサー完全にカスパーゼ活性化 – 後期アポトーシスの特徴後回復した細胞にラベルをでき、同時にアクティブなアポトーシス プロセスを識別します。このバイオ センサーは、直接または間接的に関与カスパーゼ活性細胞死の他の形態をした細胞の回復も追跡できます。したがって、このプロトコルにより、私たちは継続的にこれらの細胞との生物学的機能、分子機構、生理学的および病理学的結果との治療上の含意将来の研究を促進する彼らの子孫の運命を追跡するにはアナスタシスは。また、非アポトーシス カスパーゼ活性のin vivoを表示するからアナスタシスを受けるセルを区別するために適切なコントロールを議論しました。

Introduction

プログラムされたアポトーシスなどの細胞死は、多細胞生物1,2,3不要、負傷、または危険な細胞を排除することによって胚と通常の恒常性に重要な役割を果たしています。細胞死と生存のバランスの損失は、癌、心不全、自己免疫疾患、変性4,5,6,7,8など致命的な結果につながることができます。カスパーゼは、”ノーリターンのポイント「アポトーシス9,10、11、それとして従来考えられている死刑執行人の活性化を迅速かつ大規模な細胞解体12、トリガー 13,14,,1516。この一般的な教義に挑戦、我々 は実証が死ぬ主細胞と癌細胞を回復できるだけでも次の重要な細胞のカスパーゼ活性化後、膜ブレブ、細胞の収縮を含む死の特徴ミトコンドリアの断片化、細胞質、核 chromatin の凝縮が、DNA 損傷、核の断片化へのミトコンドリアのチトクロームcの放出細胞アポトーシス小体の形成とホスファチジルセリン (PS) の表面の露出17,18,19,20,21. 提案するそのアナスタシスは本質的な細胞回復現象、死細胞は細胞死の刺激17,18,19,20,を除去した後回復できるよう21. 私たちの造語「アナスタシスは」(Αναστάσης)18、「上昇生活に」ギリシャ語でを意味するこの予期しない細胞回復現象を記述します。アナスタシスはの私達の観察はホスファチジルセリン外在化22,23,24、限定ミトコンドリア、後細胞の回復も明らかに最近の独立した研究によってサポートされてさらに外側膜透過25キナーゼのような混合系の活性化 (MLKL) と細胞収縮26。

アナスタシスを規定しているメカニズムを特徴付けるお越しのパラダイム シフトの生理学的、病理学的、および治療の影響。アナスタシスは救助または左心室と心室をアンロードして重要な後細胞と置き換えるには、困難な組織、おそらく心不全逆転のアカウントを保持する未知の細胞保護メカニズムを表すことができます。脳損傷32後デバイス (LVADs)27,28, 視細胞の過度光29,30,31, 一時的な露出やニューロンの修理後の復旧を支援します。その場合推進アナスタシスは細胞・組織の回復を高めることができます。逆に、アナスタシスはがん細胞が細胞死誘導療法、がん再発17,18の原因を生き残るために使用予期しないエスケープ戦術かもしれない。したがって、アナスタシスは中にがん細胞が死ぬことで、がん治療後の再発を防止することによって癌を治療する新たな治療戦略を抑制します。

アナスタシスはの過程で、我々 は、アポトーシス18,20,21 の中に DNA 損傷原因の可能性が発生したこと、いくつかの回復された細胞恒久的な遺伝子変異を取得し、発癌を受けたを発見しました。.DNA ダメージを受けた細胞の死のプロセスを逆転させることができる腫瘍形成のメカニズム、食道の慢性的な熱損傷が誘発されるよう組織の様にがんのリスクを増加可能性のある組織の損傷を繰り返し観察の基礎となります。非常に熱い飲料33,34,35、アルコール中毒36,37による肝臓の損傷、腫瘍の進化の遺伝毒性癌療法38,後の消費によって39,40, および抗癌性療法41,42,43,44のサイクルの間隔中に発生した正常組織から新しい癌の開発.True の場合、アナスタシスはターゲットを防ぐ可能性があります。 または癌の発生と進行を逮捕します。我々 は、飢餓による死生殖細胞を再供給のショウジョウバエ19でアナスタシスは受けることを発見しました。 アナスタシスは DNA 損傷と生殖細胞の発生、環境ストレスを長期観察のためのアカウントは、遺伝病の開発を促進するかもしれない。たとえば、飢饉は継代継承可能な糖尿病と冠動脈心疾患45疾患の発展に貢献します。したがって、この潜在的なメカニズムに起因する継承可能な疾患の発症予防のための戦略理解アナスタシスは可能性があります。

アナスタシスはの発見を活用し、革新的な治療法の開発にそれを直接、原因とアナスタシスは生きている動物での結果を研究に不可欠です。ただし、それは技術的に識別し、細胞死のプロセスから回収した細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別がつかない表示され、アナスタシスはマーカーがないため anastatic 細胞は生体内で、追跡に挑戦します。特定まだ17,18,21。これらの問題に対処するため、我々 は最近新しい生体内でカスパーゼ バイオ センサーを識別およびカスパーゼ活性化19,46, 後アポトーシスを生き残る細胞を追跡する”CaspaseTracker”19日を指定を開発、アポトーシス10,14の特徴。スキャット12,47、Apoliner48, CA GFP49、ApoAlert18,50, C3AIs51 iCasper52 など「リアルタイム」カスパーゼ バイオ センサーとそれを区別します。にカスパーゼ活性を検出する、CaspaseTracker バイオ センサーはまた永久にも一過性細胞その特急のカスパーゼ活性にラベルを付ける機能します。したがって、CaspaseTracker バイオ センサーは、カスパーゼを介した崩細胞死のプロセスで vivo後アナスタシスはの長期追跡を可能。 にします。

Protocol

1) ハエ CaspaseTracker バイオ センサーの作製 CO2ハエを麻酔し、絵筆を使用してはえの食糧と新鮮な酵母のペーストと同じ瓶で 7 に 10 カスパーゼに依存した Gal4 (DQVD)19処女女性および 7 10 G トレース53 Gal4 記者若い男性のハエ (またはその逆) を転送します。注:カスパーゼに依存 (DQVD) Gal4 と G トレース ハエの十字架 CaspaseTracker 子?…

Representative Results

それは回復した細胞形態学的に区別がつかないためセルを受けた動物では、アナスタシスは識別するために挑戦的なコマ撮りの生細胞顕微鏡検査は、培養細胞20管アナスタシスは信頼性の高い方法は、通常の健康な細胞から、細胞死を試みていません。たとえば、ひと子宮頸癌 HeLa 細胞は細胞死に対してアポトーシス1,2,<su…

Discussion

CaspaseTracker デュアル センサー システムが斬新で、最近の検出を可能にするユニークなツールまたは進行中のカスパーゼ活性と細胞死を逆転させた細胞の追跡処理およびカスパーゼ活性体内を経て生き残るため。成長の研究が非アポトーシス カスパーゼ活性がニューロン活動79,の規制などの多様な細胞機能の潜在的な役割を果たして?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ショウジョウバエイメージ図 3 およびビデオの原稿; ありがとうダレン ObbardJ. マリー ・ ハードウィック、ウェイド ・ ギブソン、ヘザー M. ラムこの原稿の貴重な議論のため。この作業によって、卿エドワード ・ ユード記念フェローシップ (H.L.T.)、博士ウォルター Szeto 記念奨学金 (H.L.T.) が支持されたフルブライト付与生命科学研究財団フェローシップ (H.L.T.) と NCI K22 付与 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.) です。ホー ラム唐は、Shurl と生命科学研究財団 (2014-2017) ケイ Curci 財団研究員だった。

Materials

CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Citer Cet Article
Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).
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