Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Christian B. Matranga; Adrianne Gladden-Young; James Qu; Sarah Winnicki; Dolo Nosamiefan; Joshua Z. Levin; Pardis C. Sabeti

doi:10.3791/54117

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Médecine

नैदानिक नमूनों से आरएनए वायरस की निष्पक्ष गहरी अनुक्रमण

Published: July 02, 2016

doi:

10.3791/54117

Christian B. Matranga, Adrianne Gladden-Young, James Qu, Sarah Winnicki, Dolo Nosamiefan, Joshua Z. Levin, Pardis C. Sabeti²

¹Broad Institute of MIT and Harvard, ²Harvard University

Summary

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Abstract

यहाँ हम एक अगली पीढ़ी आरएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल सक्षम बनाता है कि नए सिरे से विधानसभाओं और नैदानिक और जैविक स्रोतों से एकत्र वायरल जीनोम की इंट्रा-मेजबान संस्करण कॉल रूपरेखा। विधि निष्पक्ष और सार्वभौमिक है; यह सीडीएनए संश्लेषण के लिए यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करता है और वायरल अनुक्रम सामग्री का कोई पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है। सहित पाली (आरए) वाहक और ribosomal शाही सेना – – वायरल शाही सेना नमूना से पुस्तकालय निर्माण से पहले, चयनात्मक RNase एच-आधारित पाचन अवांछित आरएनए चूस लेना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। चयनात्मक कमी दोनों डेटा की गुणवत्ता और अद्वितीय की संख्या वायरल शाही सेना अनुक्रमण पुस्तकालयों में पढ़ता में सुधार। इसके अलावा, एक Transposase-आधारित 'tagmentation' कदम प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के रूप में यह समग्र पुस्तकालय निर्माण के समय को कम कर देता है। प्रोटोकॉल के तेजी से गहरी अनुक्रमण के लिए सक्षम है और 600 से अधिक लासा इबोला वायरस के नमूने सहित दोनों के रक्त और ऊतकों को अलग-और मोटे तौर पर अन्य माइक्रोबियल जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए लागू है से संग्रह।

Introduction

नैदानिक स्रोतों से वायरस की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पारेषण और संक्रमण के महामारी विज्ञान, साथ ही मदद समर्थन उपन्यास निदान, टीका और चिकित्सीय विकास को सूचित कर सकते हैं। सीडीएनए यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग संश्लेषण का पता लगाने और अलग-अलग, सह-संक्रमण से जीनोम या यहां तक कि उपन्यास वायरस ^1,2 के विधानसभा अनुमति दी गई है। अन्य निष्पक्ष तरीकों के साथ के रूप में, अवांछित दूषित पदार्थों को कई अनुक्रमण पढ़ता है और नकारात्मक अनुक्रमण परिणामों को प्रभावित कब्जा करना था। होस्ट और पाली (आरए) वाहक आरएनए कई मौजूदा वायरल नमूना संग्रह में मौजूद दूषित पदार्थों को कर रहे हैं।

प्रोटोकॉल गहरी अनुक्रमण आरएनए वायरस निष्पक्ष कुल शाही सेना-सेक के आधार पर जीनोम के एक कुशल और लागत प्रभावी तरीके से वर्णन करता है। विधि अवांछित मेजबान ribosomal और वाहक आरएनए को हटाने के लिए एक RNase एच चयनात्मक कमी चरण ³ का इस्तेमाल करता है। चयनात्मक कमी वायरल सामग्री (चित्रा 1) के लिए समृद्ध करती और अनुक्रमण डेटा के समग्र गुणवत्ता में सुधार(चित्रा 2) नैदानिक नमूनों से। इसके अलावा, tagmentation प्रोटोकॉल के रूप में यह काफी पुस्तकालय निर्माण के समय को कम कर देता लिए आवेदन किया है। इन तरीकों में तेजी से इबोला और लासा वायरस जीनोम ^2,4,5 के बड़े डेटासेट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और आरएनए वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्त में, दृष्टिकोण मानव नमूनों तक सीमित नहीं है; चयनात्मक कमी की उपयोगिता लासा संक्रमित मूषक और गैर मानव प्राइमेट रोग मॉडल ^5,6 से एकत्र ऊतकों के नमूनों पर प्रदर्शन किया गया।

चित्रा 1. कुल शाही सेना सामग्री लासा वायरस चयनात्मक कमी का उपयोग कर सामग्री के संवर्धन को दर्शाता है। नौ विभिन्न नैदानिक वियोजन से समग्र सामग्री (आरएनए इनपुट) और अद्वितीय लासा वायरस (LASV) के संवर्धन पढ़ता (लाइब्रेरी सामग्री) rRNA कमी पर शुरू। यह आंकड़ा ⁶ से संशोधित किया गया है <em>। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2. उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण के बाद कैरियर आरएनए कमी। पाली की अनुक्रमण चक्र (आरए) प्रति माध्य आधार गुणों लासा वायरस पुस्तकालयों (लाल) और QC रिपोर्ट ¹³ से नियंत्रण (कोई वाहक पुस्तकालय में मनाया, काला) -contaminated। दोनों 1 पढ़ें और पढ़ें बनती अंत के 2 पुस्तकालय बेम फ़ाइल में विलय कर रहे हैं और गुणवत्ता स्कोर के प्रत्येक आधार पर दिखाए जाते हैं पढ़ता है। यह आंकड़ा ⁶ से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वायरल शाही सेना seq प्रोटोकॉल विवरण निकाली से सीधे पुस्तकालयों का निर्माणआरएनए नैदानिक और जैविक नमूने से एकत्र की। व्यक्तिगत सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, सभी वायरल सीरम, प्लाज्मा और ऊतकों के नमूनों आरएनए निकासी करने से पहले उचित buffers में निष्क्रिय किया जाना चाहिए। कुछ निष्क्रियता और निकासी किट में, वाहक पाली (आरए) आरएनए भी शामिल है; इस प्रारंभिक RNase एच चयनात्मक कमी चरण के दौरान हटा दिया जाएगा। पूरी तरह ठीक होने के आधार पर, वाहक आरएनए की उम्मीद है और एकाग्रता 100 एनजी / μl है। प्रोटोकॉल में, 110 एनजी / μl oligo डीटी आरएनए (1.1X वाहक एकाग्रता) की कमी के लिए प्रयोग किया जाता है। अगर पाली (आरए) वाहक नमूने में मौजूद नहीं है, तो oligo (डीटी) कमी करने से पहले नहीं जोड़ा जाना चाहिए।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल (250 μl मात्रा तक) पीसीआर थाली प्रारूप में 24 प्रतिक्रियाओं के लिए बनाया गया है। इस प्रोटोकॉल के पुराने संस्करण Matranga, एट अल में बताया गया था। ^6।

Protocol

आचार बयान: लासा बुखार रोगियों Tulane विश्वविद्यालय, हार्वर्ड विश्वविद्यालय, ब्रॉड संस्थान, Irrua विशेषज्ञ शिक्षण अस्पताल (ISTH), Kenema सरकारी अस्पताल (KGH), स्वास्थ्य, लागोस की Oyo राज्य मंत्रालय में मानव विषयों समितियों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग इस अध्ययन के लिए भर्ती किया गया , नाइजीरिया और स्वास्थ्य सिएरा लियोन मंत्रालय। सभी रोगियों की देखभाल के लिए एक समान मानक के साथ इलाज किया गया और दवा Ribavirin, या नहीं, वे अध्ययन में भाग लेने का फैसला किया है की पेशकश कर रहे थे। लासा बुखार (वामो) रोगियों के लिए, Ribavirin के साथ इलाज वर्तमान में सिफारिश की दिशा निर्देशों का पालन किया और आम तौर पर के रूप में जल्द ही वामो दृढ़ता से संदेह था के रूप में की पेशकश की थी। इबोला वायरस (ईवीडी) के लिए गंभीर फैलने के कारण, रोगियों हमारे मानक प्रोटोकॉल के माध्यम से सहमति नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय ईवीडी रोगियों से नैदानिक अतिरिक्त नमूने के उपयोग का मूल्यांकन किया और सियरा लियोन में और हार्वर्ड विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। अधिकारीसिएरा लियोन नैतिकता और वैज्ञानिक समीक्षा समिति, स्वास्थ्य और स्वच्छता के सिएरा लियोन मंत्रालय और मानव विषयों के उपयोग पर हार्वर्ड समिति के सीई अनुक्रम और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध वायरल रोगी और संपर्क नमूनों से प्राप्त दृश्यों बनाने के लिए सहमति की छूट दे दी है सिएरा लियोन में इबोला प्रकोप के दौरान एकत्र की। इन निकायों का भी प्रकोप प्रतिक्रिया के दौरान देखभाल प्राप्त सभी संदिग्ध ईवीडी रोगियों से एकत्र de-पहचान के नमूने के लिए नैदानिक और महामारी विज्ञान के डेटा के उपयोग के लिए दी गई। स्वास्थ्य और स्वच्छता के सिएरा लियोन मंत्रालय ने भी प्रकोप नमूनों की जीनोमिक अध्ययन के लिए ब्रॉड संस्थान और हार्वर्ड विश्वविद्यालय के लिए सिएरा लियोन से गैर-संक्रामक, गैर जैविक नमूने के लदान को मंजूरी दे दी। नमूना शाही सेना (अप करने के लिए 55 μl निकाले कुल शाही सेना, ~ 4 घंटा) की 1. DNase उपचार एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में बर्फ पर एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में DNase प्रतिक्रिया सेट अप तालिका 1 में वर्णित के रूप में </strong>, 1.1 चरण (कुल मात्रा 70 μl / अच्छी तरह से)। नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार हो सकता है। भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। सफाई आरएनए ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) मनकों का उपयोग। गर्म आरएनए मोती 30 मिनट के लिए आरटी के लिए। धीरे आरएनए मोती बोतल हिला किसी भी चुंबकीय कणों कि बसे हो सकता है resuspend। DNase इलाज आरएनए (70 μl) के लिए आरएनए मोतियों की 1.8x मात्रा (126 μl) जोड़ें, 10 बार पिपेट द्वारा मिश्रण और अच्छी तरह से (196 μl में कुल मात्रा) आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। चुंबकीय स्टेशन पर मिश्रण रखें। (- 10 मिनट 5) समाधान स्पष्ट करने के लिए प्रतीक्षा करें। जबकि पिपेट और त्यागने से स्टेशन पर मंजूरी दे दी समाधान निकालें। जबकि स्टेशन पर, 70% इथेनॉल के साथ गोली कवर द्वारा मोती धोने और 1 मिनट के लिए सेते हैं। पिपेट और त्यागने के साथ इथेनॉल निकालें। दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ। नोट: ठीक 70% हौसले से तैयार एट का प्रयोगhanol महत्वपूर्ण है, के रूप में एक उच्च प्रतिशत, छोटे आकार के अणुओं का अकुशल धोने में परिणाम होगा जबकि <70% इथेनॉल नमूना 7 का नुकसान हो सकता है। स्टेशन पर थाली रखें और हवा शुष्क करने के लिए खुला छोड़ दें। नोट: मोती पूरी तरह से सूखे के लिए जब तक मोती दरार करने के लिए शुरू की अनुमति देने के लिए सुनिश्चित करें। elute शाही सेना की थाली के लिए nuclease मुक्त पानी के 55 μl जोड़ें। स्टेशन से थाली निकालें अच्छी तरह से pipetting द्वारा माला और पानी के मिश्रण करने के लिए। नोट: वैकल्पिक रूप से, क्रम में कुल शाही सेना को ध्यान केंद्रित करने में (10 μl ≤) कम पानी का उपयोग करें। प्लेट स्टेशन पर वापस प्लेस। जब तक समाधान लंबी अवधि के भंडारण के लिए नए पेंच टोपी ट्यूब के लिए पिपेट द्वारा हस्तांतरण करने के लिए साफ करता है रुको (-80 डिग्री सेल्सियस)। नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में कमी के लिए जगह 5 μl आरएनए (कदम। 2.4)। वैकल्पिक:। सहेजें और rRNA की QRT- पीसीआर के लिए 19 μl पानी (1:20) में 1 μl पतला (जैसे, 18S, 28S rRNA) (तालिका 2) और वायरल मार्कर 5 </Li> वायरल शाही सेना नमूना से Ribosomal और कैरियर शाही सेना के 2 चयनात्मक कमी (~ 4 घंटा) तालिका 1 में वर्णित के रूप में रेखीय एक्रिलामाइड वाहक के साथ 5x संकरण और 10x RNase एच प्रतिक्रिया buffers, और nuclease मुक्त पानी बनाओ। एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में बर्फ पर साथ rRNA कमी ओलिगोस (3 टेबल) और oligo (डीटी) आरएनए के संयोजन तालिका 1 में वर्णित के रूप में द्वारा संकरण प्रतिक्रिया सेट करें। नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार हो सकता है। एक अनूठा सिंथेटिक आरएनए (ERCCs 8) का 50 femtograms (FG) पर नज़र रखने के लिए दोनों वायरल अनुक्रमण प्रक्रिया और संभावित सूचकांक पढ़ पार संदूषण के लिए जोड़ा जा सकता है। भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। प्रति सेकंड -0.1 डिग्री सेल्सियस पर 45 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट, धीमी गति से ramping के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 45 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler रोकें। बर्फ पर RNase एच प्रतिक्रिया मिश्रण सेट अप के रूप में वर्णनतालिका 1 में घ, तो 2 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम। नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार हो सकता है। थाली में संकरण प्रतिक्रिया करने के लिए पूर्व गर्म RNase एच मिश्रण जोड़ें, जबकि 45 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler में प्लेट रखते हुए। 8 बार – कोमल pipetting 6 से अच्छी तरह मिला लें। एक और 30 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। बर्फ पर रखें। तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर DNase प्रतिक्रिया मिश्रण सेट अप नोट:। एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता है। थाली में RNase एच प्रतिक्रिया को जोड़ें, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 5 μl 0.5 एम EDTA जोड़कर DNase प्रतिक्रिया बंद करो। भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सफाई आरएनए मोती (1.3 चरण देखें) एक 1.8x मात्रा (144 μl) मनकों का उपयोग कर का उपयोग कर। nuclease मुफ्त पानी के 11 μl में Elute। नोट: सुरक्षित कोल्ड स्टोरेज के लिए, स्टोर आर.एन. समाप्त-80 डिग्री सेल्सियस हे / एन ए नमूने हैं। 3. सीडीएनए संश्लेषण (~ 6 घंटा) मिक्स rRNA / एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में बर्फ पर यादृच्छिक प्राइमरों के साथ वाहक समाप्त आरएनए तालिका 1 में वर्णित के रूप में, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। thermocycler में 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के मिश्रण गर्मी। 5 मिनट – तुरंत गर्मी विकृतीकरण के बाद, 1 के लिए बर्फ पर शाही सेना को जगह है। आरएनए पहली कतरा प्रतिक्रिया करने से पहले की तुलना में अब 5 मिनट के लिए (यहां तक कि बर्फ पर) खड़े करने की अनुमति न दें। तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर पहली कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें। नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता। थाली में शाही सेना / यादृच्छिक प्राइमर मिश्रण में जोड़ने, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस – 22 पर सेते हैं। 60 मिनट के लिए एक हवाई इनक्यूबेटर में 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए बर्फ पर थाली रखें। नहींई: एक हवा इनक्यूबेटर का उपयोग पहली कतरा प्रतिक्रिया के दौरान जो प्राइमरों पानी रखना और पहली कतरा बढ़ाना शुरू होता है के क्रमिक वार्मिंग बनाने के लिए सिफारिश की है। तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर दूसरी कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें। नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता। थाली में पहली कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया में जोड़े, भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। 16 डिग्री सेल्सियस (25 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन रखने के लिए) पर 2 घंटे के लिए सेते हैं। तापमान 16 डिग्री सेल्सियस से ऊपर उठकर अनुमति न दें। बर्फ पर थाली प्लेस, तो 0.5 एम EDTA के 5 μl जोड़कर प्रतिक्रिया निष्क्रिय, धीरे और अच्छी तरह मिक्स, तो 1 मिनट के लिए आरटी पर 280 XG पर अपकेंद्रित्र। डीएनए मोती (प्रोटोकॉल के लिए कदम 1.3 देखें) मोतियों की 1.8x मात्रा (153 μl) का उपयोग कर के साथ सफाई। क्षालन बफर के 9 μl (ईबी) में elute। मात्रा का ठहराव के लिए 1 μl बचाओ। subseque के लिए सीडीएनए के 1 एनजी का प्रयोग करेंNT कदम। अगर सीडीएनए एकाग्रता का पता लगाने के लिए tagmentation सीडीएनए के 4 μl का उपयोग करने के लिए बहुत कम है (4.1 कदम देखें)। सुरक्षित कोल्ड स्टोरेज के लिए, दुकान पर डबल असहाय सीडीएनए 4 डिग्री सीओ / एन -20 डिग्री या लंबी अवधि के भंडारण के लिए सी। 4. पुस्तकालय तैयारी – डीएनए पुस्तकालय निर्माण (~ 4 घंटा) एक 96 अच्छी तरह से थाली पर स्थानांतरण सीडीएनए के 4 μl और एक दूसरे प्रयास के लिए शेष सीडीएनए बचाने के लिए अगर जरूरत है। तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर tagmentation प्रतिक्रिया सेट करें। नोट: एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता। पृष्ठभूमि और कुल लागत को कम करने के लिए, tagmentation प्रतिक्रिया की कुल मात्रा 20 से 10 μl से कम हो जाता है। सीडीएनए के रूप में सीमित कारक है, प्रतिक्रिया में इस्तेमाल एटीएम (यानी, transposome) की राशि भी एकीकरण साइटों की संख्या कम करने के लिए कम है। tagmentation मिश्रण 1 मिनट के लिए 280 XG (आरटी पर) पर धीरे और अच्छी तरह से और सेंट्रीफ्यूज की थाली, भंवर में सीडीएनए में जोड़े।5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। एक बार 10 डिग्री सेल्सियस पर, तुरंत प्रतिक्रिया को समाप्त करने को बेअसर Tagment बफर (एनटी) के 2.5 μl जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा मिक्स और नीचे, तो 1 मिनट के लिए 280 XG (आरटी पर) पर अपकेंद्रित्र। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। तालिका 1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया सेट करें। भंवर धीरे और अच्छी तरह से है, तो 280 XG पर आरटी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। की स्थिति तालिका 1 में वर्णित का उपयोग कर thermocycler पर पीसीआर प्रदर्शन करना। नोट: पीसीआर की 12 चक्र tagmented सीडीएनए के 1 एनजी के लिए सुझाव दिया है; हालांकि, वायरल नैदानिक नमूनों अक्सर सीडीएनए की undetectable मात्रा में है। सीडीएनए (<1 एनजी) की कम मात्रा के लिए, अनुक्रमण लिए पर्याप्त पुस्तकालय बनाने पीसीआर 18 चक्र अप करने इस्तेमाल करते हैं। तैयारी – सफाई और पूलिंग ईबी साथ 50 μl नमूना ऊपर लाओ। सफाईडीएनए मोती (प्रोटोकॉल कदम 1.3 देखें) 0.6x (30 μl) मनकों का उपयोग। 15 में elute। क्षेत्र विश्लेषण (150 1,000 बीपी लिए) bioanalyzer सॉफ्टवेयर 9, से प्राइमर dimers (~ 120 बीपी) को छोड़कर उपयोग हुए आयोजन द्वारा (चित्रा 3) एकाग्रता निर्धारण। नोट: वैकल्पिक रूप से, qpcr पुस्तकालयों 10 यों किया जा सकता है। 1 एनएम या अधिक सबसे दाढ़ पूल पुस्तकालयों। अगर नीचे है, इन अनुक्रम जानकारी पर कब्जा (अन्य ~ 1x मात्रा) एक छोटी जोड़ें। 0.7x डीएनए उल्लिखित (चरण 2 देखें)। मोतियों अंतिम निर्भर करेगा। 9 विश्लेषण। <यों है>। 10 pM पुस्तकालय एकाग्रता में लोड sequencer 101 बीपी उत्पन्न करने के लिए, बनती अंत पढ़ता दोहरी बारकोड के साथ पढ़ता है 11। 3. पुस्तकालय इबोला वायरस नैदानिक नमूनों से निर्मित चित्रा। 4 प्रतिनिधि इबोला वायरस (EBOV) पुस्तकालयों की जेल छवि। पुस्तकालय और प्राइमर dimers के क्षेत्र दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण की पीढ़ी के हैं, जबकि अद्वितीय वायरल सामग्री के लिए समृद्ध बनाने के लिए कम इनपुट वायरल शाही सेना के नमूने से पढ़ता सक्षम बनाता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, प्रोटोकॉल अद्वितीय लासा वायरस सामग्री समृद्ध कम से कम (गैर समाप्त नियंत्रण की तुलना में) सभी नमूनों में पांच गुना 18S rRNA (~ 100 पीजी की कुल आरएनए) के कम से कम एक लाख प्रतियों के साथ। इसी तरह, अनुक्रमण सफलता भी किसी नमूने के भीतर वायरस की राशि के साथ सहसंबद्ध। वायरल मात्रा के लिए एक किराए, नमूने कि ~ निहित 1000 या अधिक वायरल जीनोम प्रतियां सबसे अधिक बार पूर्ण विधानसभाओं बनाया के रूप में QRT- पीसीआर का उपयोग करना (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अलावा, पाली (आरए) वाहक की कमी एक और टी की homopolymer दृश्यों पुस्तकालयों में, चित्रा (2) कम कर देता है क्लीनर की तैयारी में है, जिसके परिणामस्वरूप और बेहतर गुणवत्ता सुनिश्चित अनुक्रमण पढ़ता है। कम इनपुट वायरल नैदानिक नमूनों से अंतिम पुस्तकालयों अक्सर 150 से 1,000 बीपी के लिए एक व्यापक टुकड़ा लंबाई है(चित्रा 3)। अनुक्रमण के बाद, एक पूल 12 के भीतर नमूना गलत पहचान और पुस्तकालयों के बीच crosstalk को कम करने के लिए, केवल सूचकांक 25 (Q25) का एक आधार गुणवत्ता स्कोर के साथ पढ़ता है और यह सुनिश्चित शून्य बेमेल demultiplexing प्रक्रिया के दौरान रखा जाता है। वायरल जीनोम एक जैव सूचना विज्ञान पाइप लाइन अलग-अलग वायरस 2,4-6 के लिए विशिष्ट का उपयोग कर इकट्ठा कर रहे हैं। इन उपकरणों https://github.com/broadinstitute/viral-ngs पर या वाणिज्यिक बादल प्लेटफार्मों 4 माध्यम से उपलब्ध हैं। 1.1 कदम: DNase प्रतिक्रिया अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) 10x DNase बफर 7 Nuclease मुक्त पानी 6 निकाले वायरल शाही सेना 55 DNase (2 यू / & #181; एल) 2 कुल मात्रा 70 5x संकरण बफर: 2.1 कदम अभिकर्मक 1 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम (μl) 5 एम NaCl 200 1 एम Tris एचसीएल (पीएच 7.4) 500 Nuclease मुक्त पानी 300 कुल मात्रा 1,000 2.1 कदम: 10x RNase एच प्रतिक्रिया बफर अभिकर्मक 1 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम (μl) 5 एम NaCl 200 1 एम Tris एचसीएल (पीएच 7.5) 500 1 एम 2 MgCl 200 Nuclease मुक्त पानी 500 कुल मात्रा 1,000 2.1 चरण: जल with रेखीय एक्रिलामाइड अभिकर्मक 1 मिलीलीटर बफर के लिए वॉल्यूम (μl) Nuclease मुक्त पानी 992 रैखिक एक्रिलामाइड (5 मिलीग्राम / एमएल) 8 कुल मात्रा 1,000 कदम 2.2: चयनात्मक कमी के लिए संकरण प्रतिक्रिया अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) 5x संकरण बफर 2 rRNA कमी oligo मिश्रण (100 माइक्रोन) के 1.22 Oligo (घ) टी (550 एनजी / μl) 1 DNase इलाज कुल शाही सेना 5 तक कील में शाही सेना (यह वैकल्पिक है) 0.5 जल (रैखिक एक्रिलामाइड के साथ) कुल 10 तक लाना कुल voluमैं 10 2.3 कदम: चयनात्मक कमी के लिए RNase एच प्रतिक्रिया अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) 10x RNase एच प्रतिक्रिया बफर 2 जल (रैखिक एक्रिलामाइड के साथ) 5 थर्मास्टाइबल RNase एच (5 यू / μl) 3 कुल मात्रा 10 2.4 कदम: DNase प्रतिक्रिया पोस्ट चयनात्मक कमी अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) 10x DNase बफर 7.5 जल (रैखिक एक्रिलामाइड के साथ) 44.5 RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) 1 RNase मुक्त DNase मैं (2.72 यू / μl) 2 </tr> कुल मात्रा (RNase एच प्रतिक्रिया के साथ) 75 3.1 चरण: सीडीएनए संश्लेषण, यादृच्छिक प्राइमर संकरण अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति मात्रा (μl) rRNA / वाहक समाप्त आरएनए 10 3 माइक्रोग्राम यादृच्छिक प्राइमर 1 कुल मात्रा 1 1 3.2 कदम: पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया अभिकर्मक मात्रा (μl) 5x पहले किनारा प्रतिक्रिया बफर 4 0.1 एम डीटीटी 2 10 मिमी dNTP मिश्रण 1 RNase अवरोध करनेवाला (20 यू / μl) 1 रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (पिछले जोड़) 1 कुल मात्रा (ऊपर शाही सेना के साथ) </Td> 20 3.3 कदम: दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया अभिकर्मक मात्रा (μl) RNase मुक्त पानी 43 10x दूसरा किनारा प्रतिक्रिया बफर 8 10 मिमी dNTP मिश्रण 3 ई कोलाई डीएनए Ligase (10 यू / μl) 1 ई कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं (10 यू / μl) 4 ई कोलाई RNase एच (2 यू / μl) 1 कुल मात्रा के साथ (1 सेंट कतरा प्रतिक्रिया) 80 4.2 कदम: Tagmentation प्रतिक्रिया अभिकर्मक मात्रा (μl) Amplicon Tagment मिक्स (एटीएम) 1 Tagment डीएनए बफर (टीडी) </tडी> 5 कुल मात्रा (सीडीएनए के साथ) 10 4.3 चरण: लाइब्रेरी पीसीआर प्रतिक्रिया अभिकर्मक मात्रा (μl) पीसीआर मास्टर मिक्स (एनपीएम) 7.5 सूचकांक 1 प्राइमर (i7) 2.5 सूचकांक 2 प्राइमर (i5) 2.5 कुल मात्रा (tagmented सीडीएनए के साथ) 25 चरण 4.3.2: लाइब्रेरी पीसीआर की स्थिति 72 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड 18 चक्र-10 95 डिग्री सेल्सियस पर सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 30 सेकंड तक 72 डिग्री सेल्सियस पर 72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट 10 डिग्री सेल्सियस, हमेशा के लिए <p class="jove_content"fo: रख-together.within-पेज = "1"> तालिका 1:। रिएक्शन सेट-अप और buffers कदम-दर-कदम सभी buffers और प्रतिक्रिया घोला जा सकता है की सामग्री के साथ टेबल। oligo नाम अनुक्रम (5 '3' के लिए) इबोला KGH परिवार कल्याण GTCGTTCCAACAATCGAGCG इबोला KGH आर.वी. CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT इबोला Kulesh परिवार कल्याण TCTGACATGGATTACCACAAGATC इबोला Kulesh आर.वी. GGATGACTCTTTGCCGAACAATC लासा SL परिवार कल्याण जीटीए एजीसी सीसीए GCD GYA AAB सीसी लासा SL आर.वी. आग सीसीए कैग एएए RCT GGS एजीसी एक 18S rRNA परिवार कल्याण TCCTTTAACGAGGATCCATTGG 18S rRNA आर.वी. CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </tसक्षम> तालिका 2: QRT- पीसीआर प्राइमर दृश्यों मेजबान (18S rRNA) और वायरल (इबोला और लासा) सामग्री को मापने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों।। 'KGH' सिएरा लियोन, जहां इबोला प्राइमरों 2 में परीक्षण किया गया Kenema सरकारी अस्पताल है। 'Kulesh' अन्वेषक जो प्राइमर सेट 14 बनाया गया है। तालिका 3: Ribosomal आरएनए (rRNA) रिक्तीकरण ओलिगोस 195 50-न्यूक्लियोटाइड लंबे दृश्यों चयनात्मक कमी चरण 6 के लिए मानव rRNA के पूरक।। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

उल्लिखित दृष्टिकोण मजबूत, सार्वभौमिक, तेजी अनुक्रमण सक्षम बनाता है और 2014 के प्रकोप ^2,4 दौरान इबोला वायरस क्रमबद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चयनात्मक कमी और tagmentation पुस्तकालय निर्माण के साथ सीडीएनए संश्लेषण युग्मन, समग्र प्रक्रिया में समय पिछले एडाप्टर बंधाव तरीकों से ~ 2 दिन की कमी थी। अभी हाल ही में इस प्रोटोकॉल बड़ी सफलता ^15,16 के साथ अंतरराष्ट्रीय सहयोगियों और अन्य लोगों द्वारा नियोजित किया गया था और स्थानीय जीनोमिक्स आधारित अनुसंधान अध्ययन और निदान ¹⁷ समर्थन करने के लिए पश्चिम अफ्रीका में प्रयोगशालाओं के लिए तैनात किया जाएगा।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करता वायरल शाही सेना seq पुस्तकालयों के लिए सीडीएनए तैयार करने के लिए। पिछले वायरल शाही सेना seq दृष्टिकोण के विपरीत, यह कोई एक विशिष्ट वायरस या क्लेड के लिए अनुक्रम डेटा या विस्तृत और समय लेने वाली प्रथम डिजाइन की एक प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता है। विधि किसी भी वायरल शाही सेना के नमूने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह दोनों इबोला से वायरल सामग्री उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाऔर लासा नमूने ^6। प्रोटोकॉल भी मेजबान transcriptomic, metagenomic और रोगज़नक़ खोज अनुक्रमण परियोजनाओं ^{1 के} लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण कदम लक्षित है RNase एच पाचन, एक उच्च throughput, वायरल के नमूनों से अवांछित वाहक और मेजबान आरएनए को दूर करने के लिए कम लागत विधि। प्रोटोकॉल के चुनिंदा कमी कदम कई घटकों का उपयोग करता है और कौशल और सटीकता की आवश्यकता है। अतिरिक्त समय और देखभाल प्रारंभिक सेटअप के दौरान लिया जाना चाहिए।

के रूप में सबसे नैदानिक सीरम और प्लाज्मा नमूनों अक्सर बहुत कम न्यूक्लिक एसिड सामग्री है, प्रदूषण और नमूना नुकसान आम हैं। इन मुद्दों से बचने के लिए, विशेष ध्यान जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए। सबसे पहले, आरएनए अत्यधिक गिरावट की संभावना है; इसलिए सभी क्षेत्रों को स्वच्छ और न्युक्लिअसिज़ से मुक्त होना चाहिए। दूसरा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए उपयुक्त नमूनों की पहचान करने के लिए, दोनों मेजबान शाही सेना और वायरस के लिए QRT- पीसीआर assays मात्रा का ठहराव ^5,6 के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए </sup>। इनपुट की तुलना प्रोटोकॉल से अनुक्रमण परिणाम, अनुक्रमण सफलता के साथ मात्रा में जब (यानी, पूर्ण वायरल विधानसभा के लिए पर्याप्त डेटा की पीढ़ी) के नमूने है कि निहित कम से कम 100 पीजी कुल शाही सेना और वायरस के 1,000 प्रतियों के साथ सहसंबद्ध। तीसरा, न्यूक्लिक एसिड की पर्यावरण सूत्रों के जोखिम से बचा जाना चाहिए। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल सुरक्षा सावधानियों के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में और पर्यावरण दूषित पदार्थों को सीमित करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, हमारे समूह और दूसरों को देखा है वाणिज्यिक एंजाइमों कम इनपुट नमूने में बैक्टीरिया ^6,18 न्यूक्लिक एसिड को दूषित करने का एक और स्रोत हो सकता है। एक साफ कार्यक्षेत्र (जैसे, पीसीआर हुड, जैव सुरक्षा कैबिनेट) और नकारात्मक नियंत्रण का प्रयोग करें (जैसे, पानी या बफर) को कम करने में मदद करेगा और प्रदूषण को ट्रैक, क्रमशः। साथ नमूने के लिए <कुल शाही सेना के 100 पीजी, केवल पाली (आरए) वाहक शाही सेना, नहीं rRNA, उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण परिणाम सुनिश्चित करने के लिए है, जबकि माल के नुकसान को सीमित करने से समाप्त किया जाना चाहिए। के लिए बहुतकम इनपुट के नमूने, सीडीएनए प्रवर्धन विधियों, अधिक उपयुक्त ¹⁹ हो सकता है, हालांकि पाली (आरए) वाहक सीडीएनए संश्लेषण से पहले हटा दिया जाना चाहिए।

मेजबान rRNA की कमी अनुक्रमण पुस्तकालयों में वायरल सामग्री के लिए समृद्ध करती और सीरम या प्लाज्मा, और मूषक और गैर मानव प्राइमेट ^5,6 से ऊतकों के कई प्रकार सहित विभिन्न नमूना संग्रह करने के लिए लागू है। गैर मानव जीवों में, संरेखित पढ़ता 28S rRNA के लिए कमी के बाद बने रहे, सुझाव 28S rRNA मानव और अन्य प्रजातियों ^6,20 के बीच कम संरक्षित है। गैर मानव वियोजन के साथ इस पद्धति का उपयोग करते हैं, यह विशिष्ट मेजबान ^3,21 की विविधतावादी rRNA दृश्यों के लिए पूरक डीएनए ओलिगोस के साथ पूरक करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

चूंकि प्रोटोकॉल निष्पक्ष है, वायरल केवल कुल पुस्तकालय सामग्री का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व कर सकते पढ़ता है। हालांकि rRNA मेजबान शाही सेना के सबसे प्रचुर मात्रा में प्रजातियों और केवल rRNA का एक छोटा सा प्रतिशत पढ़ता है (0, 1%) पाए जाते हैं चयनात्मक कमी के बाद, अन्य सभी मेजबान आरएनए (जैसे, mRNA) की कमी के बाद बनी रहती है और कई अनुक्रमण के लिए नमूना से पढ़ता खाते सकता होगा। इसलिए "oversampling" (यानी, oversequencing) व्यक्तिगत पुस्तकालयों वायरल विधानसभा और संस्करण कॉल के लिए पर्याप्त कवरेज करने के क्रम में आवश्यक है। हमारे अध्ययन के लिए, हम अनुक्रम करने का प्रयास ~ 20 मिलियन वायरल जीनोमिक और संबद्ध वेरिएंट के विश्लेषण के लिए पर्याप्त गहराई के साथ ही metagenomic सामग्री ^2,5 राशि के लिए नमूना प्रति पढ़ता है। metagenomic और रोगज़नक़ खोज पढ़ाई के लिए, यह ध्यान दें कि दूषित मेजबान डीएनए DNase पाचन द्वारा हटा दिया जाता है महत्वपूर्ण है। इसलिए वायरस और अन्य रोगाणुओं कि डीएनए जीनोम शामिल प्रक्रिया के दौरान खो दिया जा सकता है, तथापि आरएनए मध्यवर्ती अभी भी अनुक्रम किया जा सकता है।

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

Materials

96-Well PCR Plates	VWR	47743-953
Strips of Eight Caps	VWR	47745-512
Nuclease-free water	Ambion	AM9937	50 ml bottle
TURBO DNase	Ambion	AM2238	post RNA extraction step, 2 U/µL, buffer included
PCR cycler			any PCR cyclers
Agencourt RNAClean XP SPRI beads	Beckman Coulter Genomics	A63987	beads for RNA cleanup
Real Time qPCR system			any system
DynaMag-96 Side Skirted Magnet	Invitrogen	12027
70% Ethanol			prepare fresh
qRT-PCR primers	IDT DNA		see Table 2
5M NaCl	Ambion	AM9760G
1M Tris-HCl pH 7.4	Sigma	T2663-1L
1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
1M MgCl₂	Ambion	AM9530G
Linear acrylamide	Ambion	AM9520
DNA oligos covering entire rRNA region	IDT DNA		see Table 3, order lab-ready at 100 µM
Oligo (dT)	IDT DNA		40 nt long, desalted
Hybridase Thermostable RNase H	Epicentre	H39100
RNase-free DNase Kit	Qiagen	79254	post selective depletion step
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Random Primers	Invitrogen	48190-011	mostly hexamers
10 mM dNTP mix	New England Biolabs	N0447L
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080-093	with first-strand buffer, DTT
Air Incubator			any air incubator cyclers
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer	New England Biolabs	B6117S	10x
E. coli DNA Ligase	New England Biolabs	M0205L	10 U/μl
E. coli DNA Polymerase I	New England Biolabs	M0209L	10 U/μl
E. coli RNase H	New England Biolabs	M0297L	2 U/μl
0.5M EDTA	Ambion	AM9261
Agencourt AMPure XP SPRI beads	Beckman Coulter Genomics	A63881	beads for DNA cleanup
Elution Buffer	Qiagen		10 mM Tris HCl, pH 8.5
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q32857
Nextera XT DNA Sample Prep Kit	Illumina	FC-131-1096
Nextera XT DNA Index Kit	Illumina	FC-131-1001
Tapestation 2200	Agilent	G2965AA
High Sensitivity D1000 reagents	Agilent	5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584
BioAnalyzer 2100	Agilent	G2939AA
High Sensitivity DNA reagents	Agilent	5067-4626
Library Quantification Complete kit (Universal)	Kapa Biosystems	KK4824	alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification

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Citer Cet Article

Matranga, C. B., Gladden-Young, A., Qu, J., Winnicki, S., Nosamiefan, D., Levin, J. Z., Sabeti, P. C. Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples. J. Vis. Exp. (113), e54117, doi:10.3791/54117 (2016).