تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد Cyanine الأصباغ
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتركيب 2'-آلكاين تعديل النووي الريبي منقوص الأكسجين حامض (DNA) خيوط من قبل الآلي توليف المرحلة الصلبة باستخدام الكيمياء phosphoramidite القياسية. وصفت [أليغنوكليوتيد ما بعد صناعي من قبل اثنين من cyanine الأصباغ صامد جديدة باستخدام المحفز النحاس النقر الكيمياء. ووصف تركيب كل من الجهات المانحة ومتقبل صبغ ويتم تنفيذ في ثلاث خطوات متتالية. مع الحمض النووي كما أن الهيكل المحيطة بها، وهذه الأصباغ اثنين من الخضوع لنقل الطاقة عندما يتم تقديمهم الى مقربة من التهجين. لذلك، هو تصور الصلب اثنين واحد جدائل الحمض النووي تقطعت بهم السبل بسبب تغيير اللون مضان. يتميز هذا التغيير اللون عن طريق التحليل الطيفي مضان ولكن يمكن أيضا أن نلاحظ مباشرة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة (الأشعة فوق البنفسجية). مفهوم مزدوج قراءات اللون مضان يجعل هذه التحقيقات النوكليوتيد أدوات ممتازة للتصوير الجزيئي خصوصا عندما هواتف وصفهوتستخدم الأصباغ tostable. وبالتالي، يتم منع photobleaching من لتحقيقات التصوير، والعمليات البيولوجية يمكن ملاحظتها في الوقت الحقيقي لفترة زمنية أطول.
Introduction
يمثل التصوير الجزيئي تقنية أساسية لفهم العمليات البيولوجية داخل الخلايا الحية. 1-3 تطوير تحقيقات الفلورسنت الحمض النووي على أساس لمثل هذه التطبيقات الكيميائية البيولوجية أصبح حقل البحوث التوسع. وتحتاج هذه تحقيقات الفلورسنت لتلبية بعض المتطلبات لتصبح أدوات مناسبة لتصوير الخلايا. أولا، يجب أن الأصباغ تطبيقها تظهر مضان ذات العوائد العالية الكم، والتحولات الكبيرة ستوكس، والأهم من ذلك، photostabilities مرتفعة للسماح طويلة الأجل في مجال التصوير الجسم الحي. وثانيا، ينبغي أن تظهر قراءات مضان يمكن الاعتماد عليها. وتعتمد أنظمة حامل اللون-فاكهه تقضي التقليدية على قراءات من لون مضان واحد عن طريق تغييرات بسيطة في كثافة مضان. 4 هذا النهج يحمل خطر من النتائج السلبية الإيجابية أو كاذبة كاذبة بسبب تألق ذاتي من مكونات داخل الخلايا أو انخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التبريد غير مرغوب فيه من قبل شركات أخرى لponents 4
بلغنا مؤخرا على مفهوم "إشارات المرور الحمض النووي" التي تظهر مزدوجة قراءات اللون مضان باستخدام اثنين من حاملات مختلفة. 5-6 ويستند مفهوم على نقل الطاقة (ET) من الصبغة المانحة إلى صبغ متقبل الذي يتغير مضان اللون (انظر الشكل 1). هذا يسمح للقراءات أكثر موثوقية، وبالتالي يوفر أداة قوية لتحقيقات التصوير الفلورسنت. وضع البطاقات التعريفية على أليغنوكليوتيد مع الأصباغ الفلورية يمكن أن يتحقق من خلال نهجين مختلفين. ويمكن إدراج الأصباغ خلال توليف الحمض النووي الكيميائي في مرحلة الصلبة باستخدام كتل بناء phosphoramidite تعديل تبعا لذلك. 7 يقتصر هذا الأسلوب إلى الأصباغ التي هي مستقرة في ظل phosphoramidite وdeprotection الظروف القياسية. وكبديل لذلك، تم إنشاء منهجيات تعديل آخر الاصطناعية في الكيمياء النوكليوتيد. هنا، علينا أن نظهر تركيب واحدة من الصور الجديدةالطاقة الجدول نقل أزواج 8،9 ووضع العلامات آخر الاصطناعية من الحمض النووي باستخدام المحفز النحاس 1،3-cycloaddition بين أزيدات والألكاينات (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
ويظهر هذا البروتوكول الإجراء الكامل لتسمية الحمض النووي بعد صناعي عبر CuAAC بواسطة الأصباغ الفلورية المعدلة أزيد. وهذا يشمل تركيب الأصباغ والحمض النووي المعدلة آلكاين فضلا عن إجراءات وضع العلامات.
تركيب الأصباغ يتبع أربع خطوا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدعم المالي من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG، وا 1386 / 17-1)، والتدريب البحثي المجموعة GRK 2039 (التي تمولها DFG) وKIT ما قدمه من مساعدة.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
