Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
In dit protocol tonen we een werkwijze voor de synthese van 2'-alkyn gemodificeerd desoxyribonucleïnezuur (DNA) strengen door geautomatiseerde vaste fase synthese onder toepassing van standaard fosforamidietchemie. Oligonucleotiden worden post-synthetisch gelabeld door twee nieuwe photostable cyaninekleurstoffen met behulp van koper-gekatalyseerde click-chemie. De synthese van donor en acceptor kleurstof wordt beschreven en wordt uitgevoerd in drie opeenvolgende stappen. Het DNA als de omringende architectuur, beide kleurstoffen energieoverdracht ondergaan wanneer zij door hybridisatie dicht bij elkaar worden gebracht. Daarom is annealen van twee enkelstrengs DNA strengen zichtbaar gemaakt door een verandering van fluorescentie kleur. Deze kleurverandering wordt gekenmerkt door fluorescentiespectroscopie maar kunnen ook direct worden waargenomen met behulp van een handheld ultraviolet (UV) lamp. Het concept van een dubbele fluorescentiekleur uitlezing maakt deze oligonucleotideprobes uitstekende instrumenten voor moleculaire beeldvorming vooral bij de beschreven photostable kleurstoffen worden gebruikt. Daardoor wordt fotobleken van de beeldvormende sondes voorkomen en biologische processen in real time worden waargenomen voor een langere tijdsperiode.
Introduction
Moleculaire beeldvorming is een fundamentele techniek voor het begrijpen van biologische processen in levende cellen. 03/01 De ontwikkeling van fluorescerende nucleïnezuur gebaseerde probes voor dergelijke chemische-biologische toepassingen is een groeiende onderzoeksveld geworden. Deze fluorescerende probes nodig hebt om een paar eisen te voldoen om een geschikte tool voor cell imaging geworden. Ten eerste moet de toegepaste kleurstoffen fluorescentie met hoge kwantumopbrengsten vertonen grote Stokes verschuivingen en vooral hoge photostabilities langdurige in vivo beeldvorming mogelijk. En ten tweede moeten ze een betrouwbare fluorescentie uitlezing te tonen. Conventionele chromofoor-quencher-systemen zijn gebaseerd op het uitlezen van een enkele fluorescentie kleur door eenvoudige veranderingen in fluorescentie-intensiteiten. 4 Deze benadering draagt het risico van vals positieve of vals negatieve resultaten als gevolg van autofluorescentie van intracellulaire componenten of lage signaal-ruisverhouding door ongewenste uitdoving door andere comonderdelen. 4
We hebben onlangs gemeld op het begrip "DNA verkeerslichten 'die dubbele fluorescentiekleur uitlezingen tonen door twee verschillende chromoforen. 5-6 Het concept is gebaseerd op de energieoverdracht (ET) vanaf de donorkleurstof de acceptor kleurstof waarvan de fluorescentie verandert kleur (zie figuur 1). Dit maakt een meer betrouwbare uitlezing en verschaft daardoor een krachtig hulpmiddel voor fluorescentie beeldvorming probes. Etikettering van oligonucleotiden met fluorescerende kleurstoffen kan worden bereikt door twee verschillende benaderingen. Kleurstoffen kunnen tijdens de chemische DNA synthese worden opgericht op een vaste fase met overeenkomstige gemodificeerde fosforamidiet bouwblokken. 7 Deze werkwijze is beperkt tot kleurstoffen die stabiel onder standaard fosforamidiet en deprotectie omstandigheden. Als alternatief werden post-synthetische modificatie methoden vastgesteld oligonucleotide chemie. Hier tonen we de synthese van een van onze nieuwe foto'stabel energieoverdracht paren 8,9 en de post-synthetische labeling van DNA door het gebruik van koper-gekatalyseerde 1,3-cycloadditie tussen aziden en alkynen (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol toont de volledige procedure te labelen DNA post-synthetisch via CuAAC by-azide gemodificeerde fluorescerende kleurstoffen. Dit omvat de synthese van de kleurstoffen en alkyn-gemodificeerd DNA en de werkwijze voor het merken.
De synthese van de kleurstoffen volgt vier stappen. Alle producten kunnen worden verkregen door een vrij eenvoudige neerslag als gevolg van hun positieve lading en geen tijdrovende kolomchromatografie nodig is. De invoering van het azide functionaliteiten v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiële steun door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), de Research Training Group GRK 2039 (gefinancierd door de DFG) en KIT is dankbaar erkend.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
