المظهرية والتحليل الوظيفي من المنشط خلايا تنظيم تي المعزولة من الفئران المصابة بفيروس المزمنة الليمفاوي المشيمي
Summary
Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Abstract
التنظيمية تي (T ريج) الخلايا، التي تعبر عن Foxp3 كعامل النسخ، هي مجموعات فرعية من خلايا CD4 + T. خلايا تي ريج تلعب أدوارا حاسمة في التسامح المناعة، وصيانة التوازن من خلال تنظيم الاستجابة المناعية. الدور الأساسي للخلايا ريج T هو قمع انتشار المستجيب تي (T EFF) الخلايا وإنتاج السيتوكينات مثل IFN-γ، TNF-α، و IL-2. وقد ثبت أن قدرة خلايا T ريج "لمنع وظيفة الخلايا ممثل المؤسسة تي تتعزز خلال العدوى الممرض استمرار وتطور مرض السرطان. لتوضيح وظيفة الخلايا ريج T تحت يستريح أو الملتهبة الظروف، ومجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر قمع باستخدام الماوس أو تي الخلايا البشرية ريج وقد وضعت. والهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة لمقارنة الاختلافات في النمط الظاهري وظيفة القمعية بين الراحة والمفعلين تي ريجالخلايا. لعزل تنشيط خلايا T ريج، والفئران المصابة مع الليمفاوي فيروس التهاب السحايا المشيمي (LCMV) استنساخ 13 (CL13)، سلالة مزمن في LCMV. خلايا تي ريج معزولة عن الطحال من الفئران المصابة CL13-LCMV أظهرت كل من النمط الظاهري تنشيط وتعزيز النشاط القمعية مقارنة مع يستريح خلايا ريج تي المعزولة من الفئران ساذجة. هنا، نحن تصف البروتوكول الأساسي للخارج الحي تحليل النمط الظاهري للتمييز تنشيط خلايا T ريج من يستريح خلايا تي ريج. وعلاوة على ذلك، نحن تصف بروتوكول لقياس النشاط القمعية من خلايا ريج T تشغيلها بالكامل.
Introduction
التنظيمية خلايا تي (T ريج) تعبر عن P3 مربع forkhead (Foxp3) باعتباره عامل النسخ لتنميتها وظيفة 1. بالإضافة إلى ذلك، خلايا تي ريج تعبر عن مختلف الجزيئات الأخرى مثل CD25 2، اللمفاويات التنشيط الجيني 3 (LAG-3) 3، الناجم عن جلايكورتيكود عامل نخر الورم مستقبلات 4، والسامة للخلايا اللمفاوية التائية-بروتين يرتبط 4 (CTLA-4) 5 على سطحها أو منطقة داخل الخلايا. خلال العدوى المزمنة مع أنواع مختلفة من مسببات الأمراض مثل الفيروسات 6،7، 8،9 البكتيريا، والطفيليات 10-12، أو في سياق تطور مرض السرطان 13،14، تصبح خلايا T ريج متباينة في خلايا تفعيلها، تظهر تعزيز وظيفة القمعية خلايا تستهدف المستجيب CD4 + و CD8 + T. وقد اقترح عدد من الأوراق أن الخلايا ريج T توسيع وتنشيط تساهم في ضعف في رد و الخلايا CD8 + Tالبريد خلال صديق الارتجاعي (اناث) عدوى 15-17. الناجم FV-خلايا تي ريج تمنع IFN-γ أو التعبير باء granzyme للتفاعل السامة للخلايا من خلايا CD8 + T 15-17. وعلاوة على ذلك، في الهربس البسيط نموذج عدوى فيروس، أفيد أن استنفاد الخلايا ريج CD4 + CD25 + T أدى إلى توسيع الخلايا CD8 + T الفيروس محددة وتلف الأنسجة الشديد نتيجة لتسلل immunopathogenic خلايا CD4 + T 18-20.
الفئران المصابة بشكل مزمن مع سلالة استنساخ 13 من فيروس المشيمي اللمفاوي (LCMV CL13) 21-24 وقد استخدمت على نطاق واسع لوصف النمط الظاهري وظيفة الخلايا التائية المستجيب (T EFF) والخلايا ريج T خلال عدوى فيروس المزمن. خلال العدوى LCMV المستمر، الفيروس محددة الخلايا التائية ممثل المؤسسة يفقد تدريجيا وظيفة المستجيب وأصبحت منهكة خلايا تي (T EXH). من ناحية أخرى، Tخلايا ريج تعزز قدرتها على قمع الفيروس محددة تي استجابة الخلية 25. انخفاض في قدرة فاعلة من الخلايا ممثل المؤسسة T يمكن تفسيرها من خلال عدة عوامل مثل upregulation من المستقبلات المثبطة على خلايا ممثل المؤسسة T، وظيفة تغيير الخلايا العارضة للمستضد، وإنتاج السيتوكينات immunoregulatory، وزيادة تواتر أو تعزيز وظيفة تي ريج خلايا 26. ومن بين العوامل التي تدخل في تي قمع الخلايا، موت الخلية المبرمج البروتين 1 (PD-1) واعتبرت على نطاق واسع -expressing خلايا EXH تي وخلايا T ريج باعتبارها من أهم دعامات استمرار مستضد والبيئة القمعية. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الحصار المفروض على مسار PD-1 والاجتثاث من خلايا ريج T يؤدي إلى تعزيز وظيفة الخلايا التائية وانخفض الحمل الفيروسي خلال LCMV عدوى مزمنة 27. وعلاوة على ذلك، يتم تنشيط خلايا T ريج خلال العدوى المزمنة من الفئران مع LCMV 23،25 </sتصل> وتعزيز وظيفتها القمعية 25. وأعربت PD-1 كبير على خلايا T ريج وكذلك خلايا T EXH، ومستوى PD-1 أعرب من قبل خلايا ريج T يرتبط مع قوة من وظيفتها القمعية لمنع انتشار الخلايا التائية 25.
هنا، نحن تصف طريقة لمقارنة خصائص الخلايا ريج T تنشيط معزولة من الفئران المصابة مع LCMV CL13 ويستريح خلايا تي ريج معزولة من الفئران ساذجة. وعلاوة على ذلك، نفسر سلسلة من العمليات لفصل تنشيط خلايا T ريج ودراسة على النمط الظاهري خارج الحي، وكذلك قياس النشاط القمعية في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من مجرد عدد قليل من الخلايا ريج T موجودة في الفئران والبشر، فمن المهم أن نفهم وظيفة لأنها تلعب دورا حاسما في تنظيم الاستجابة المناعية والحفاظ على التسامح المناعي. عدد والقمعية وظائف تي ريج خلايا زيادات خلال عدوى فيروس المزمن 15-20 وكذلك سرطا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
Materials
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
| Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
| PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
| L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
| Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
| CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
| Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
