Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques
Summary
Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Abstract
Cellules régulatrices T (T reg), qui expriment Foxp3 comme un facteur de transcription, sont des sous – ensembles de cellules T CD4 +. Lymphocytes T reg jouent un rôle crucial dans la tolérance immunitaire et le maintien de l' homéostasie en régulant la réponse immunitaire. Le rôle principal des cellules T reg est de supprimer la prolifération des T effecteurs (Teff) des cellules et la production de cytokines telles que l' IFN-γ, le TNF-α et IL-2. Il a été démontré que la capacité des cellules T Reg pour inhiber la fonction des cellules T eff est augmentée au cours de l' infection par le pathogène persistant et le développement du cancer. Afin de clarifier la fonction des cellules T reg sous repos ou enflammées conditions, une variété de tests in vitro de suppression en utilisant des cellules reg souris ou T humains ont été mis au point. L'objectif principal de cette étude est de développer une méthode pour comparer les différences dans le phénotype et la fonction suppressive entre repos et T reg activécellules. D'isoler des cellules T activées reg, les souris ont été infectées avec le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) , le clone 13 (CL13), une souche de LCMV chronique. Lymphocytes T reg isolés de la rate des souris infectées par LCMV-CL13 présentaient à la fois le phénotype activé et l' activité suppressive accrue par rapport aux cellules T au repos reg isolées à partir de souris naïves. Ici, nous décrivons le protocole de base pour une analyse ex vivo de phénotype de distinguer les cellules reg T activées à partir de cellules au repos T reg. En outre, on décrit un protocole pour la mesure de l'activité suppressive des cellules T reg complètement activés.
Introduction
Cellules régulatrices T (T reg) expriment forkhead box P3 (Foxp3) en tant que facteur de transcription pour leur développement et la fonction 1. En outre, les cellules T reg expriment diverses autres molécules telles que CD25 2, le gène lymphocyte activation 3 (LAG-3) 3, d'une tumeur du récepteur du facteur de nécrose induite par glucocorticoïde-4 et des lymphocytes T cytotoxiques-associated protein 4 (CTLA-4) 5 sur leur surface ou la région intracellulaire. Au cours de l' infection chronique par divers types d'organismes pathogènes tels que les virus, les bactéries 6,7 à 8,9 et les parasites 10-12, ou dans le cadre du développement du cancer 13,14, les cellules T reg se différencient en cellules activées, l' affichage amélioré la fonction suppressive des cellules effectrices CD4 + et de ciblage T CD8 +. Un certain nombre d'articles ont suggéré que les cellules T reg élargies et activées contribuent aux responsab dépréciés de lymphocytes T CD8 +e pendant ami retrovirus (FV) infection 15-17. Cellules T reg FV-induites inhibent l' IFN-γ ou l' expression du granzyme B et réactivité cytotoxique des cellules T CD8 + 15-17. En outre, dans un modèle d'infection par le virus de l' herpès simplex, il a été rapporté que l' épuisement des cellules reg CD4 + CD25 + T conduit à l' expansion de cellules T CD8 + spécifiques du virus et de graves lésions tissulaires par une infiltration de cellules T CD4 + immunopathogènes 18-20.
Les souris infectées de manière chronique avec la souche 13 clone du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV CL13) 21-24 ont été largement utilisés pour caractériser le phénotype et la fonction des cellules T effectrices (T eff) et des cellules T reg durant une infection virale chronique. Au cours de l' infection par LCMV persistante, les cellules eff spécifique du virus T perdent progressivement leur fonction d'effecteur et deviennent des cellules épuisées T (T exh). D'un autre côté, Tcellules reg renforcent leur capacité à supprimer la réponse cellulaire spécifique du virus T 25. La diminution de la capacité de fonctionnement des cellules eff T peut être expliquée par plusieurs facteurs tels que la régulation positive des récepteurs inhibiteurs sur les cellules eff T, la fonction altérée des cellules présentatrices d'antigène, la production de cytokines immunorégulatrices, et augmentation de la fréquence ou de la fonction améliorée de T reg cellules 26. Parmi les facteurs impliqués dans la suppression des cellules T, la mort cellulaire programmée protein-1 (PD-1) exprimant les cellules éch T et les cellules T reg ont été largement considérées comme les caractéristiques de l' antigène de persistance et de l' environnement suppressive. Récemment, il a été signalé que le blocage de la voie PD-1 et l' ablation des cellules T reg conduit à l' amélioration de la fonction des cellules T et une diminution de la charge virale au cours LCMV infection chronique 27. En outre, les cellules T reg sont activées lors de l' infection chronique de souris avec 23,25 LCMV </sup> et leur fonction suppressive est renforcée 25. PD-1 est fortement exprimé sur les lymphocytes T reg ainsi que des cellules T EXH, et le niveau de PD-1 exprimé par les cellules T reg est en corrélation avec la force de leur fonction suppressive pour inhiber la prolifération des lymphocytes T 25.
Ici, nous décrivons une méthode pour comparer les caractéristiques des cellules T activées reg isolées à partir de souris infectées par LCMV CL13 et de repos des cellules T reg isolées de souris naïves. En outre, nous expliquons une série de processus pour séparer les cellules reg T activées et examiner leur ex vivo phénotype, ainsi que de mesurer leur activité suppressive in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que seulement un petit nombre de cellules T reg existe chez les souris et les humains, il est important de comprendre leur fonction , car ils jouent un rôle crucial dans la régulation de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance immunitaire. Le nombre et les suppresseurs fonctions de T reg cellules augmente au cours d' une infection chronique par le virus 15-20 ainsi que la progression du cancer 13,14. Ceci est probablement dû à la stimulation antig?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
Materials
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
| Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
| PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
| L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
| Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
| CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
| Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
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