Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Regulatory T (T reg) Zellen, die Foxp3 als Transkriptionsfaktor exprimieren, sind Untergruppen von CD4 + T – Zellen. T reg – Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immuntoleranz und Homöostase Wartung durch die Immunantwort regulieren. Die primäre Rolle der T reg Zellen ist , die Proliferation von Effektor – T (T eff) Zellen und die Produktion von Zytokinen wie IFN-γ, TNF-α und IL-2 zu unterdrücken. Es wurde gezeigt , dass T reg Zellen die Fähigkeit , die Funktion von T – Zellen zu hemmen eff während persistent Pathogen – Infektion und der Entwicklung von Krebs verbessert. Um die Funktion von T reg Zellen unter ruhenden oder entzündeten Bedingungen, die eine Vielzahl von de – vitro – Unterdrückung Tests unter Verwendung von Maus oder humanen T – reg – Zellen klären entwickelt worden. Das Hauptziel dieser Studie ist es, ein Verfahren zu entwickeln , um die Unterschiede im Phänotyp und unterdrückende Funktion zwischen ruhenden und aktivierten T reg zu vergleichenZellen. Um aktivierten T – reg – Zellen wurden die Mäuse infiziert mit lymphatischer choriomeningitis Virus (LCMV) Klon 13 (CL13), eine chronische Belastung von LCMV isolieren. T reg Zellen aus der Milz von LCMV CL13-infizierten Mäusen isoliert zeigten sowohl die aktivierten Phänotyp und verbesserte suppressive Aktivität gegenüber T – Zellen aus naiven reg Mäusen isoliert ruht. Hier beschreiben wir die Basisprotokoll für ex vivo – Phänotyp – Analyse aktivierten T – reg – Zellen unterscheiden von T reg ruhenden Zellen. Weiterhin beschreiben wir ein Protokoll für die Messung der suppressive Aktivität von vollständig aktivierten T reg Zellen.
Regulatorische T (T reg) Zellen exprimieren forkhead box P3 (Foxp3) als Transkriptionsfaktor für ihre Entwicklung und Funktion 1. Zusätzlich exprimieren T reg Zellen verschiedene andere Moleküle wie CD25 2, Lymphozytenaktivierung Gen 3 (LAG-3) 3, Glucocorticoid-induzierter Tumor necrosis factor receptor 4 und zytotoxische T-Lymphozyten assoziiertes Protein 4 (CTLA-4) 5 auf ihrer Oberfläche oder intrazelluläre Region. Während einer chronischen Infektion mit verschiedenen Arten von Krankheitserregern wie Viren 6,7, Bakterien 8,9 und Parasiten 10-12, oder im Verlauf der Krebsentwicklung 13,14 geworden T reg Zellen in aktivierten Zellen differenziert, verbesserte Unterdrückungsfunktion anzeigt Targeting – Effektor CD4 + und CD8 + T – Zellen. Eine Reihe von Arbeiten haben vorgeschlagen , dass erweitert und aktivierten T – reg – Zellen auf die Beeinträchtigung der CD8 + T – Zell – respons beitragene während Freund Retrovirus (FV) Infektion 15-17. FV-induzierte T – Zellen hemmen reg IFN-γ oder Granzym B Expression und zytotoxische Reaktivität von CD8 + T – Zellen 15-17. Darüber hinaus wurde in einem Herpes simplex – Virus – Infektionsmodell berichtet geführt , die Depletion von CD4 + CD25 + T – Zellen in reg Expansion der virusspezifischen CD8 + T – Zellen und schwere Gewebeschäden durch Infiltration von immunopathogenen CD4 + T – Zellen 18-20.
Mäuse chronisch mit dem 13 – Stamm von lymphatischer choriomeningitis Virusklon infiziert (LCMV CL13) 21-24 haben den Phänotyp und die Funktion der Effektor – T – Zellen (T eff) und T reg Zellen während der chronischen Virusinfektion weit verbreitet zu charakterisieren. Während persistent LCMV – Infektion, Virus-spezifischen T – Zellen eff schrittweise ihre Effektor – Funktion verlieren und erschöpft T (T exh) Zellen werden. Auf der anderen Seite, Treg Zellen verstärken ihre Fähigkeit , 25 Virus-spezifischen T – Zell – Antwort zu unterdrücken. Die Abnahme der Funktionsfähigkeit der T eff Zellen kann durch verschiedene Faktoren wie Aufregulation von inhibitorischen Rezeptoren auf T eff Zellen veränderte Funktion von Antigen-präsentierenden Zellen, die Herstellung von immunregulatorischen Zytokine und erhöhter Frequenz oder verstärkte Funktion von T reg erklärt Zellen 26. Unter den Faktoren , die bei T – Zell – Unterdrückung, den programmierten Zelltod – Protein-1 (PD-1) exprimierenden T exh Zellen und T – reg – Zellen wurden als Kennzeichen der Antigen Persistenz und unterdrückende Umwelt weit betrachtet. Vor kurzem wurde berichtet , dass die Blockade des PD-1 – Weg und Ablation von T reg Zellen verbesserte T – Zell – Funktion führen und Viruslast während LCMV chronischen Infektion 27 verringert. Darüber hinaus werden T reg Zellen während einer chronischen Infektion von Mäusen mit LCMV aktiviert 23,25 </sup> und ihre unterdrückende Funktion 25 verstärkt. PD-1 ist stark auf T – Zellen exprimiert reg sowie T exh Zellen und der Grad der PD-1 durch T – Zellen exprimiert reg korreliert mit der Stärke ihrer suppressive Funktion T – Zell – Proliferation 25 zu hemmen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren mit den Merkmalen von aktivierten T – reg – Zellen von Mäusen , infiziert mit LCMV CL13 und ruhenden T reg Zellen isoliert aus naiven Mäusen isoliert zu vergleichen. Weiterhin erläutern wir eine Reihe von Prozessen aktiviert T reg Zellen zu trennen und ihre ex vivo Phänotyp zu untersuchen, sowie ihre suppressive Aktivität in vitro zu messen.
Obwohl nur eine kleine Anzahl von T reg Zellen in Mäusen und Menschen vorhanden sind , ist es wichtig , ihre Funktion zu verstehen , wie sie die Immunantwort bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der Immuntoleranz eine wichtige Rolle spielen. Die Anzahl und die unterdrückenden Funktionen von T reg Zellen erhöht sich während einer chronischen Virusinfektion 15-20 sowie Krebsprogression 13,14. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der fortgesetzten Antigen-Stimulation. Zur Au…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |