Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей
Summary
Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Abstract
Регуляторные Т (Т р) клетки, которые выражают Foxp3 как транскрипционный фактор, являются подмножествами CD4 + Т – клеток. Т – клетки играют Reg критическую роль в иммунной толерантности и поддержания гомеостаза путем регуляции иммунного ответа. Основная роль клеток Т рег является подавление пролиферации эффекторных Т (Т эфф) клеток и выработку цитокинов , таких как IFN-gamma, TNF-alpha и IL-2. Было показано , что способность Т Reg клеток к ингибировать функцию Т – клеток эфф усиливается во время хронической инфекции патогеном и развития рака. Для уточнения функции клеток Т рег под покоящихся или воспаленных условиях, разнообразие лабораторных анализов подавления в с помощью мыши или человека Т – клетки REG были изобретены. Основной целью данного исследования является разработка метода для сравнения различий в фенотип и супрессивной функции между отдыхавших и активированные Т регклетки. Для выделения активированные Reg Т – клеток, мышей инфицировали вирусом лимфоцитарного хореоменингита (LCMV) клона 13 (CL13), хроническое напряжение LCMV. Клетки Т рег , выделенные из селезенки LCMV CL13-инфицированных мышей обнаруживалось как активированный фенотип и повышенную активность по сравнению с супрессивной покоящихся клеток Т – Reg , выделенных из нативных мышей. Здесь мы опишем базовый протокол для анализа экс естественных условиях фенотипа , чтобы отличить активированные клетки Т – REG от покоя Т рег клеток. Кроме того, мы опишем протокол для измерения подавляющей активности полностью активированных клеток Т рег.
Introduction
Регуляторные Т (Т р) клетки экспрессируют Forkhead коробки P3 (FOXP3) в качестве фактора транскрипции для их развития и функции 1. Кроме того, клетки Т – Reg выражают различные другие молекулы , такие как CD25 , 2, ген-лимфоцитами активации 3 (LAG-3) 3, индуцированной глюкокортикоидами фактор некроза опухоли рецепторов 4, и цитотоксические Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4 (CTLA-4) 5 на их поверхности, или внутриклеточной области. При хронической инфекции с различными видами патогенов , таких как вирусы, бактерии 6,7 8,9 и паразитов 10-12, или в процессе развития рака 13,14, клетки Т рег дифференцируются в активированных клетках, демонстрируя повышенную функцию подавляющий нацеливание эффекторных CD4 + и CD8 + Т – клеток. Ряд работ предположили , что расширенные и активированные Т – клетки рег способствуют обесцененных RESPONS CD8 + Т – клетоке во друга ретровируса (FV) инфекции 15-17. FV-индуцированных Т рег клетки ингибируют IFN-gamma или экспрессию гранзимом и цитотоксическую реактивность CD8 + Т – клеток 15-17. Кроме того, в модели вирусной инфекции простого герпеса, сообщалось , что истощение клеток CD4 + CD25 + Т рег привело к расширению вирус-специфических CD8 + Т – клеток и повреждения тяжелой ткани за счет инфильтрации immunopathogenic CD4 + Т – клеток 18-20.
Мыши инфицированных хронически штаммом вируса лимфоцитарного хориоменингита клон 13 (LCMV CL13) 21-24 широко используются для характеристики фенотипа и функции эффекторных Т – клеток (Т EFF) и Т – клеток рег при хронической вирусной инфекции. Во время хронической инфекции LCMV, вирус-специфические Т эфф клетки постепенно теряют свою функцию эффекторной и разрядиться T (T л.д.) клетки. С другой стороны, Tрег клетки усиливают их способность подавлять реакцию вирус-специфических Т – клеток 25. Снижение в функционировании емкости ЕФФ Т – клеток можно объяснить несколькими факторами , такими как повышающей регуляции ингибиторных рецепторов на эфф Т – клеток, измененную функцию антиген-представляющих клеток, продукции иммунорегуляторных цитокинов и увеличение частоты или расширенной функции Т рег 26 клетки. Среди факторов , участвующих в подавлении Т – клеток, программируемая гибель клеток белок-1 (ПД-1) -expressing клетки EXH Т и Т – клетки , Reg широко рассматривается в качестве признаков антигена персистенции и ингибирующее среды. Недавно было сообщено о том, что блокада PD-1 и пути абляции клеток Т рег приводить к усилению функции Т – клеток и снижение вирусной нагрузки во время LCMV хронической инфекции 27. Кроме того, клетки Т рег активируются при хронической инфекции мышей с LCMV 23,25 </sвверх> и их подавляющая функция усиливается 25. PD-1 сильно экспрессируется на Т рег клеток, а также Т – клетки EXH, а уровень PD-1 , выраженное рег Т – клеток коррелирует с силой , подавляющей функции ингибировать пролиферацию Т – клеток на 25.
Здесь мы опишем метод для сравнения характеристик активированных Т – клеток , выделенных из рег мышей , инфицированных LCMV CL13 и клеток покоящихся Т рег , выделенных из наивных мышей. Кроме того, мы объясняем ряд процессов , чтобы отделить активированные клетки Т – REG и проверяет их ех естественных фенотипа, а также измерить их подавляющую активность в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на то, лишь небольшое число клеток Т – рег существуют у мышей и человека, важно , чтобы понять их функцию , поскольку они играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа и поддержания иммунной толерантности. Номерные и подавляющие функции Т рег клеток увеличиваетс?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
Materials
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
| Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
| PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
| L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
| Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
| CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
| Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
