Fenotypisk och funktionell analys av aktiverade regulatoriska T-celler isolerade från kronisk lymfatisk koriomeningitvirus-infekterade möss

Summary

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (T_reg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the T_reg cells.

Abstract

Regulatoriska T (T _reg) celler, vilka uttrycker Foxp3 som en transkriptionsfaktor, är undergrupper av CD4 ⁺ T-celler. T _reg celler spelar avgörande roller i immuntolerans och homeostas underhåll genom att reglera immunsvaret. Den primära rollen av _T-reg-celler är att undertrycka proliferationen av effektor-T (T _eff) celler och produktionen av cytokiner såsom IFN-γ, TNF-α, och IL-2. Det har visats att T _reg cellernas förmåga att inhibera funktionen av _T-eff celler förstärks under ihållande patogen infektion och utveckling av cancer. För att förtydliga funktionen av _T-reg celler under vila eller inflammerade villkor, ett flertal in vitro-undertrycknings analyser med användning av mus eller humant T _reg-celler har uppfunnits. Huvudsyftet med denna studie är att utveckla en metod för att jämföra skillnaderna i fenotyp och undertryckande funktion mellan vilande och aktiverade T _regceller. För att isolera aktiverade _{T-reg-celler,} möss infekterade med lymfocytär koriomeningitvirus (LCMV) klon 13 (CL13), en kronisk stam av LCMV. T _reg-celler isolerade från mjälten hos LCMV CL13-infekterade möss uppvisade både den aktiverade fenotypen och förbättrad suppressiv aktivitet jämfört med vilande T _reg celler som isolerats från naiva möss. Här beskriver vi den grundläggande protokollet för ex vivo fenotyp analys att skilja aktiverade _T-reg-celler från vilande T _reg-celler. Dessutom beskriver vi ett protokoll för mätning av den undertryckande aktiviteten hos helt aktiverade _{T-reg-celler.}

Introduction

Regulatoriska T (T _reg) celler uttrycker forkhead box P3 (Foxp3) som en transkriptionsfaktor för deras utveckling och funktion ^1. Dessutom T _reg-celler uttrycker olika andra molekyler såsom CD25 ^2, lymfocyt-aktivering gen 3 (LAG-3) ^3, glukokortikoid-inducerad tumömekrosfaktor-receptor ^4, och cytotoxisk T-lymfocyt-associerat protein 4 (CTLA-4) ⁵ på sin yta eller intracellulära regionen. Under kronisk infektion med olika typer av patogener, såsom virus ^6,7, bakterier ^8,9 och parasiter ^10-12, eller i samband med cancerutveckling ^13,14, blir T _reg-celler differentieras till aktiverade celler, visar förbättrad undertryckande funktion inriktnings effektor CD4 ⁺ och CD8 ⁺ T-celler. Ett antal artiklar har föreslagit att expanderade och aktiverade _T-reg-celler bidrar till osäkra CD8 ⁺ T-cells response under vän retrovirus (FV) infektion ^15-17. FV-inducerade T _reg-celler inhiberar IFN-γ eller granzym B-uttryck och cytotoxiska reaktivitet av CD8 ⁺ T-celler ^15-17. Dessutom i ett herpes simplex-virus infektionsmodell, rapporterades det att utarmning av CD4 ⁺ CD25 ^{+ _T-reg-celler} resulterade i expansion av virusspecifika CD8 ⁺ T-celler och allvarlig vävnadsskada genom infiltrering av immunopathogenic CD4 ⁺ T-celler ^18-20.

Möss infekterade kroniskt med klon 13-stammen av lymfocytisk koriomeningitvirus (LCMV CL13) ^21-24 har ofta använts för att karakterisera fenotypen och funktionen av effektor-T-celler (T _eff) och T _reg-celler under kronisk virusinfektion. Under ihållande LCMV infektion, virus-specifika T _eff celler förlorar gradvis sin effektorfunktion och blir utmattad T (T _exh) celler. Å andra sidan, T_reg-celler förstärker deras förmåga att undertrycka virusspecifikt T-cellsvar ^25. Minskningen i den fungerande kapacitet av T _eff celler kan förklaras av flera faktorer, såsom uppreglering av hämmande receptorer på T _eff celler, förändrad funktion av antigenpresenterande celler, produktion av immunregulatoriska cytokiner, och ökad frekvens eller ökad funktion av _T-reg celler ^26. Bland de faktorer som är involverade i T-cellundertryckning, programmerad celldöd protein-1 (PD-1) uttryckande T _EXH celler och _T-reg-celler har allmänt betraktas som kännetecken av antigen uthållighet och undertryckande miljö. Nyligen rapporterades det att blockaden av PD-1 vägen och ablation av _T-reg-celler leder till förbättrad funktion T-cell och minskad virusbelastning under LCMV kronisk infektion ^27. Vidare är T _reg-celler aktiveras under kronisk infektion av möss med LCMV ^23,25 </supp> och deras undertryckande funktion stärks ^25. PD-1 uttrycks kraftigt på T _reg-celler såväl som T _EXH celler, och nivån på PD-1 uttrycks av T _reg-celler korrelerar med styrkan av sin suppressiva funktionen att inhibera T-cellsproliferation ^25.

Här beskriver vi en metod för att jämföra egenskaperna hos aktiverade _T-reg-celler som isolerats från möss infekterade med LCMV CL13 och vilande T _reg celler som isolerats från naiva möss. Dessutom förklarar vi en rad processer för att separera aktiverade _T-reg-celler och undersöka deras ex vivo fenotyp, samt mäta deras undertryckande aktivitet in vitro.

Protocol

I denna studie gavs möss hölls i en specifik patogen-fri anläggning av Yonsei Laboratory Animal Research Center av Yonsei University. Alla djurförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer som koreanska Food and Drug Administration med hjälp av protokoll som godkänts av International Animal Care och användning kommitté Yonsei Laboratory Animal Research Center vid Yonsei University. 1. Beredning av lösningar Förbereda 2% RPMI medier genom att späda fetalt bovint serum (…

Representative Results

Vi genererade möss med motståndskraftigt virus infektion genom att injicera dem med 2 x 10 6 PFU av LCMV CL13 intravenöst. För att undersöka de fenotypiska förändringar i T reg-celler och T conv celler under kronisk virusinfektion, var mjältlymfocyter erhållna från naiva och infekterade möss färgades med olika antikroppar och analyserades med flödescytometri. Vid 16 d pi, var PD-1 uppregleras i både Foxp3 – CD4 + T <sub…

Discussion

Även om det finns bara ett litet antal av _T-reg-celler i möss och människor, är det viktigt att förstå deras funktion eftersom de spelar en avgörande roll i regleringen av immunförsvaret och bibehålla immuntolerans. Siffer och undertryckande funktioner T _reg celler ökar under en kronisk virusinfektion ^15-20 samt cancerutveckling ^13,14. Detta är troligen på grund av fortsatt antigenstimulering. För att utvärdera T _reg celler fungera under antigen uthål…

Materials

FITC Rat Anti-Mouse CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714	Use this reagent for cell surface staining.
U-Bottom Tissue Culture Plates		BD Biosciences	353077
Fixation buffer		BD Biosciences	554655	Use this reagent for cell surface staining.
FITC Rat Anti-Mouse CD25	7D4	BD Biosciences	553072	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cell strainer, 70mm		BD Biosciences	352350	Use this strainer for grinding the whole spleen.
Cell strainer, 40mm		BD Biosciences	352340	Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Life Sciences	SH30027
PBS (1X)		GE Life Sciences	SH30256
ACK Lysing Buffer		Gibco	A10492-01
L-Glutamine, 200mM solution		Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit		Life technologies	L-34975	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns		Miltenyibiotec	130-042-901	Use this column for Treg cell isolation
MACS Separation Columns, LS columns		Miltenyibiotec	130-042-401	Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation
EDTA, 0.5M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Mercaptoethanol		Sigma Life Science	M7522
Fetal Bovine Serum		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II flowcytometer		BD Biosciences		Flow cytometer*
Flowjo		TreeStar		Flow cytometry software†
Hematocytomer		Marienfeld superior