La visualisation de la surface captif grande molécules d'ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison
Summary
We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Abstract
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Introduction
Visualisation de grandes molécules d'ADN attachés sur des surfaces de verre ou de perles a été utilisé pour étudier les interactions ADN-protéine, la dynamique des protéines sur le substrat d'ADN, de 1,2 et la physique des polymères 3,4 . Une plate – forme unique asservies de grandes molécules d'ADN a peu distincte avantages par rapport à d' autres méthodes d' ADN d'immobilisation. 5 d' abord, une grande molécule d'ADN attaché à la surface a une naturelle conformation aléatoire bobine sans un flux de cisaillement, ce qui est très important pour une protéine de liaison à l' ADN à reconnaître son site de liaison. En second lieu, il est très facile de changer l'environnement chimique dans les molécules d'ADN d'une série de réactions enzymatiques dans une chambre d'écoulement. En troisième lieu , un flux de cisaillement induit microfluidique ADN moléculaire d' étirage allant jusqu'à 100% de la longueur totale du contour, ce qui est très difficile à réaliser en utilisant les autres élongation d'ADN approches telles que l' immobilisation de la surface de confinement 6 et nanocanal. 7 Une entièrement stretched molécule d'ADN contient également des informations de position qui peuvent être utiles pour surveiller les mouvements enzymatiques sur la carte génomique.
Néanmoins, l'approche de l'ADN d'attache a une lacune critique en ce que le intercalant colorant tel que YOYO-1 provoque généralement des molécules d'ADN attachés à être facilement brisées par la lumière d'excitation de fluorescence. En règle générale, les grandes molécules d'ADN doivent être colorées avec un colorant fluorescent pour la visualisation sous un microscope à fluorescence. A cet effet, YOYO-1 ou d' autres colorants de la série de TOTO sont principalement utilisés parce que ces colorants fluorescents seulement quand ils intercalent ADN double brin. 8 Cependant, il est bien connu que les bis-intercalation colorant provoque l' ADN induite par la lumière photo-clivage parce de l'intercalation de fluorophores. 9 en outre, les molécules d'ADN colorées par fluorescence attachés à la surface sont plus fragiles car les flux de cisaillement peuvent exercer des forces de rupture se déplacer librement sur des molécules d'ADN. Par conséquent, nous avons développé FP-DBP comme un roman DNA-coloration des protéines de colorant pour former une image de grandes molécules d'ADN attachés à la surface. L'avantage de l' utilisation de FP-DBP est qu'il ne provoque pas de photo-clivage des molécules d'ADN auquel il se lie. 10 En outre, FP-DBP ne pas augmenter la longueur du contour de l' ADN, tandis que les bis-colorants intercalants augmentent la longueur du contour d'environ 33%.
Cette méthode vidéo présente l'approche expérimentale pour attacher les grandes molécules d'ADN sur une surface PEG-biotine. La figure 1 illustre les différentes approches de attacher l' ADN avec des extrémités franches et des extrémités cohésives. Ainsi, cette méthode de coloration peut être appliquée à tout type de molécule d'ADN. La figure 2 illustre une représentation schématique de l'ensemble de chambre de débit qui peut être commandé par une pompe à seringue pour générer des flux de cisaillement pour étirer les molécules d'ADN ainsi que pour charger chimique et enzymatique des solutions. la figure 3 montre des micrographies de molécules d'ADN complètement étirées attachés sur la PEGylatsurface ed 11 et colorées avec FP-DBP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons une plate-forme de visualisation de longues molécules d'ADN biotinylées pour l'ancrage sur les surfaces. Nous avons rapporté une approche pour les molécules d'ADN attachés sur une surface protéine avidine revêtue d'biotinylé sérum – albumine bovine. 6 Dans la première approche, nous avons trouvé un problème crucial de l' ADN photo-clivage provoqué par les colorants bis-intercalation qui tachent les molécules d'ADN attaché sur la surface. Etant donn?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
Materials
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
References
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