Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Summary

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Abstract

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Introduction

Visualisierung großer DNA – Moleküle gebunden auf Glas oder Perlenoberflächen wurde zur Untersuchung von DNA-Protein – Wechselwirkungen, Proteindynamik auf DNA – Substrat, ^1,2 und Polymerphysik verwendet. ^3,4 Eine Plattform für Single-tethered großen DNA – Molekülen hat ein paar deutliche Vorteile gegenüber anderen DNA Immobilisierungsverfahren. ⁵ Erstens hat ein großes DNA – Molekül auf der Oberfläche gebunden eine natürliche ungeordneten Konformation ohne Scherströmung, die für ein DNA-bindendes Protein von entscheidender Bedeutung ist seine Bindungsstelle zu erkennen. Zweitens ist es sehr einfach, die chemische Umgebung um DNA-Moleküle für eine Reihe von enzymatischen Reaktionen in einem Strömungsraum zu ändern. Drittens ist ein Mikrofluidik – Scherströmung induziert DNA – Molekular zu 100% der vollen Konturlänge Dehnung auf, was sehr schwierig ist , die alternative DNA – Verlängerung wie Oberflächenimmobilisierung ⁶ und Nanokanal Haft nähert sich zu erreichen. ⁷ A vollständig stretched DNA-Molekül stellt auch eine Positionsinformation, die zur Überwachung der enzymatischen Bewegungen auf der genomischen Karte nützlich sein kann.

Dennoch hat die DNA Anbinden Ansatz eine kritische Nachteil dadurch, dass der interkalierende Farbstoff wie YOYO-1 in der Regel verursacht tethered DNA-Moleküle leicht durch Fluoreszenzanregungslicht durchbrochen werden. Im Allgemeinen große DNA-Moleküle mit einem fluoreszierenden Farbstoff zur Sichtbarmachung unter einem Fluoreszenzmikroskop gefärbt werden. Hierzu YOYO-1 oder andere TOTO Reihe Farbstoffe sind in erster Linie verwendet , da diese Farbstoffe nur fluoreszieren , wenn sie doppelsträngige DNA interkalieren. ⁸ Es ist jedoch bekannt , dass bis-interkalierenden Farbstoffes verursacht lichtinduzierten DNA Photospaltungs weil fluoreszierend gefärbte DNA – Moleküle der Interkalation von Fluorophore. ⁹ Ferner ist auf der Oberfläche gebunden sind empfindlicher , da Scherströmungen ausüben können Kräfte brechen auf frei DNA – Moleküle bewegen. Daher entwickelten wir FP-DBP als neuartige DNA-Anfärbung Proteinfarbstoff zum Abbilden großer DNA-Moleküle an der Oberfläche gebunden. Der Vorteil der Verwendung von FP-DBP ist , dass es nicht photo Spaltung der DNA – Moleküle bindet , an die verursacht. ¹⁰ Außerdem FP-DBP nicht die Konturlänge von DNA nicht erhöht, während bis-interkalierende Farbstoffe , die Konturlänge erhöhen um etwa 33%.

Dieses Video – Methode stellt die experimentellen Ansatz zu einer PEG-Biotin – Oberfläche großer DNA – Moleküle zu binden. Abbildung 1 unterschiedliche Ansätze von Anbindehaltung DNA mit stumpfen Enden und klebrigen Enden zeigt. Somit kann diese Färbemethode für jede Art von DNA – Moleküls angewandt werden. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Strömungskammeranordnung , die durch eine Spritzenpumpe gesteuert werden kann , um Scherströmungen erzeugen , um DNA – Moleküle als auch zu laden , Chemikalien- und Enzym strecken Lösungen. 3 zeigt Mikroaufnahmen von vollständig gestreckten DNA – Moleküle auf der PEGylat gefesselteed Fläche ¹¹ und gefärbt mit FP-DBP.

Protocol

1. DNA Biotinylierung Biotinylierung von blunt ended DNA unter Verwendung von Terminal – Transferase (TdT) Hinweis: Die Verwendung von T4-DNA (166 kbp), das eine stumpfe ended DNA ist. Zugabe von 5 & mgr; l von 2,5 mM CoCl 2, 5 & mgr; l 10 × Reaktionspuffer, 0,5 ul 10 mM Biotin-11-dUTP, 0,5 ul terminaler Transferase (10 Einheiten) und 0,5 ul T4 – DNA (0,5 ug / ul) zu dem Reaktionsgemisch. Machen zu einem Endvolumen von 50 &…

Representative Results

Figur 1 zeigt zwei verschiedene DNA Anbinden Methoden in Abhängigkeit von terminalen Strukturen des DNA – Moleküls. 1a veranschaulicht , wie die klebrigen Enden DNA – Moleküle mit komplementären biotinylierten Oligonukleotiden hybridisiert werden, die auf dem Avidin-beschichteten PEG Oberfläche immobilisiert sind. 1b zeigt die Zugabe von biotinyliertes ddNTP oder dNTP an die Hydroxylgruppe eines stumpfen ended DNA durch terminale Tr…

Discussion

Hier präsentieren wir eine Plattform zur Visualisierung von langen DNA-Molekülen biotinyliert für auf Oberflächen zu verankern. Wir haben einen Ansatz für die DNA – Moleküle gebunden an eine Avidin Protein beschichtete Oberfläche mit biotinyliertem Rinderserumalbumin berichtet. ⁶ In der früheren Ansatz, fanden wir eine entscheidende Frage der DNA – Photospaltung durch Bis-Einlagerungs Farbstoffe verursacht wird, die auf die gefesselte DNA – Moleküle Fleck Oberfläche. Da diese kontinuierlich angeregt…

Materials

1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22×22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulferic acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95 % Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35 % in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99 % Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9 % Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9 % Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534———-K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99 % Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76x26x1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.