Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide
Summary
We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Abstract
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Introduction
La visualizzazione di grandi molecole di DNA impastoiati sulle superfici di vetro o perline è stato utilizzato per lo studio delle interazioni DNA-proteina, la dinamica delle proteine su substrato di DNA, 1,2 e fisica dei polimeri. 3,4 Una piattaforma per le grandi molecole di DNA a singolo tethered ha pochi distinta vantaggi rispetto ad altri metodi di immobilizzazione DNA. 5 primo, una grande molecola di DNA legato sulla superficie ha una naturale conformazione random coil senza un flusso di taglio, che è criticamente importante per una proteina di legame al DNA di riconoscere suo sito di legame. In secondo luogo, è molto facile cambiare l'ambiente chimico intorno molecole di DNA per una serie di reazioni enzimatiche in una camera di flusso. In terzo luogo, un flusso di taglio microfluidico induce DNA molecolare estende fino al 100% della lunghezza del profilo completo, che è molto difficile da ottenere con allungamento DNA approcci alternativi come superficie di immobilizzazione 6 e nanochannel confinamento. 7 Un completamente stretched molecola di DNA fornisce anche informazioni di posizione che può essere utile per il controllo dei movimenti enzimatici sulla mappa genomica.
Tuttavia, l'approccio tethering DNA ha una lacuna critica che tintura del intercalante come YOYO-1 provoca generalmente molecole di DNA legato ad essere facilmente rotto dalla luce di fluorescenza di eccitazione. Generalmente, grandi molecole di DNA devono essere colorato con un colorante fluorescente per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. A questo scopo, YOYO-1 o altri coloranti della serie TOTO sono utilizzati principalmente perché questi coloranti fluorescenti solo quando intercalare DNA a doppia elica. 8 Tuttavia, è ben noto che bis intercalanti colorante provoca DNA indotta dalla luce foto-scissione, perché della intercalazione di fluorofori. 9 Inoltre, molecole di DNA fluorescente macchiate impastoiati in superficie sono più fragili in quanto i flussi di taglio possono esercitare rottura forze sul liberi di muoversi molecole di DNA. Pertanto, abbiamo sviluppato FP-DBP come un romanzo Ddye proteina NA-colorazione per l'imaging di grandi molecole di DNA impastoiati in superficie. Il vantaggio di utilizzare FP-DBP è che non provoca foto-scissione delle molecole di DNA a cui si lega. 10 Inoltre, FP-DBP non aumenta la lunghezza del profilo del DNA, mentre bis-intercalanti coloranti aumentano la lunghezza del profilo di circa il 33%.
Questo metodo di video introduce l'approccio sperimentale per legare grandi molecole di DNA ad una superficie PEG-biotina. La Figura 1 illustra i diversi approcci di legare il DNA con estremità smussata ed estremità appiccicose. Così, questo metodo di colorazione può essere applicato a qualsiasi tipo di molecola di DNA. La Figura 2 illustra una rappresentazione schematica del gruppo camera di flusso che può essere controllata da una pompa a siringa per generare flussi di taglio per allungare molecole di DNA e per caricare chimica ed enzimatica soluzioni. la figura 3 mostra micrografie di molecole di DNA completamente allungato impastoiati sul PEGylatdi superficie ed 11 e colorati con FP-DBP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui vi presentiamo una piattaforma per la visualizzazione di molecole di DNA lunghe biotinilati per l'ancoraggio sulle superfici. Abbiamo riportato un approccio per molecole di DNA impastoiati su una superficie rivestita proteina avidina con biotinilato albumina sierica bovina. 6 Nell'approccio in precedenza, abbiamo trovato una questione cruciale del DNA foto-scissione causata da coloranti bis-intercalazione che macchiano molecole di DNA legato alla superficie. Poiché questi fluorofori continuamente…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
Materials
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
References
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