펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

Summary

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Abstract

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Introduction

유리 구슬 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 시각화 DNA 기판 ^1,2- 고분자 물리학 DNA – 단백질 상호 작용, 단백질 역학 조사에 이용되었다. ^3,4- 단일 닿는 큰 DNA 분자를위한 플랫폼 구별 몇 갖는다 이점, 다른 DNA의 고정화 방법으로 비교 하였다. ⁽⁵⁾ 우선, 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 결합 부위를 인식하는 DNA 결합 단백질에 대한 중요하다 전단 흐름없이 자연스러운 임의 코일 형태를 갖는다. 둘째, 유동 챔버에서 일련의 효소 반응에 대한 DNA 분자 주위의 화학적 환경을 변경하는 것은 매우 쉽다. 셋째, 미세 유체 전단 흐름 대안 DNA 신장을 사용하여 달성하는 것은 매우 어렵다 전체 윤곽 길이의 100 %까지 연신 분자량 DNA는 표면 고정화 ⁶ 및 나노 채널 가둠으로 접근 ^{유도한다.도 7a} stretche 완전히D DNA 분자는 게놈지도에서 효소의 움직임을 모니터링하는 데 유용 할 수의 위치 정보를 제공한다.

그럼에도 불구하고, DNA 테 더링 방식은 YOYO-1은 일반적으로 닿는 DNA 분자가 용이 형광 여기 광에 의해 파손되게로서 그 인터 염료의 중요한 단점을 갖는다. 일반적으로, 많은 DNA 분자는 형광 현미경 시각화 형광 염료로 염색 될 수있다. 이를 위해, YOYO-1 또는 다른 TOTO 계 염료는 이중 가닥 DNA를 층간 삽입 할 때 이러한 염료 만 형광 때문에 주로 사용된다. ⁽⁸⁾ 단, 비스 인터 염료 광 – 유도 DNA의 광 분열로 인해 발생하는 것이 잘 알려져 형광체의 인터. ⁹ 항, 표면에 닿는 형광 염색 DNA 분자는 전단 흐름이 자유롭게 DNA 분자 이동에 힘을 깨고 발휘할 수 있기 때문에 더 약하고. 따라서, 우리는 새로운 D-FP로 DBP 개발표면에 닿는 큰 DNA 분자 이미징 NA 단백질 염색 염료. FP-DBP를 사용하는 이점은 그것이 바인딩하는 DNA 분자의 광 분열이 발생하지 않는다는 것이다. ⁽¹⁰⁾ 또한 비스 인터 염료 윤곽 길이를 증가하면서, FP-DBP는 DNA의 윤곽 길이가 증가하지 않는다 약 33 % 정도.

이 비디오 방법은 PEG-비오틴 표면에 큰 DNA 분자를 테 더링에 대한 실험 방법을 소개합니다. (1) 평활 말단 스티커 끝으로 DNA를 테 더링의 서로 다른 접근 방식을 보여줍니다. 따라서, 이러한 착색 방법은 DNA 분자의 모든 유형에 적용 할 수있다. 2 DNA 분자를 늘릴뿐만 아니라 화학적 및 효소를로드하는 전단 흐름을 생성하기 위해 주사기 펌프에 의해 제어 될 수 유량 용기 조립체의 개략적 인 표현을 도시 한 도표 솔루션을 제공합니다. 그림 3은 PEGylat에 닿는 완전히 뻗어 DNA 분자의 현미경 사진을 보여줍니다에드면 ⁽¹¹⁾ 및 FP-DBP로 염색.

Protocol

1. DNA 바이오 티 닐화 터미널 트랜스퍼하여 블런트 엔드 DNA의 바이오 티 닐화 (TDT) 참고 : 무딘 엔드 DNA이다 사용 T4 DNA (166 KBP)를. 2.5 밀리미터의의 CoCl2, 10 × 반응 버퍼의 5 μL, 10 mM의 비오틴-11-dUTP를 0.5 μL, 터미널 전이 0.5 μL (10 대), 및 T4 DNA의 0.5 μL (0.5 μg의 / μL)을 5 μl를 추가 반응 혼합물에 관한 것이다. 물 38.5 μL를 첨가하여 50 ㎕의 최종 부피로 만든다. </…

Representative Results

도 1은도 1b도.도 1a는 스티키 종단 DNA 분자가 아비딘 코팅 된 PEG 상에 고정화 상보 오티 닐화 올리고 뉴클레오티드 혼성화 방법을 도시한다. DNA 분자의 말단 구조에 따라 두 개의 서로 다른 DNA 테 더링 방법을 도시의 첨가를 보여준다 바이오틴 어떤 ddNTP 또는 터미널 전이에 의해 무딘 엔드 DNA의 3 '히드 록실 그룹의 dNTP. …

Discussion

여기에 우리가 표면에 고정을 위해 비오틴 긴 DNA 분자를 시각화 플랫폼을 제시한다. 우리는 바이오틴 소 혈청 알부민과 아비딘 단백질이 코팅 된 표면에 닿는 DNA 분자에 대한 접근 방식. ⁶ 이전 방법에서보고, 우리는에 닿는 DNA 분자를 얼룩 비스 – 인터 염료에 의한 DNA의 사진 분열의 중요한 문제를 발견 표면. 이러한 지속적 여기 형광체는 여기 광 전력이 광 분열을 방지하기 위해 최소화?…

Materials

1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22×22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulferic acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95 % Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35 % in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99 % Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9 % Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9 % Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534———-K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99 % Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76x26x1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.