La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido
Summary
We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Abstract
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Introduction
La visualización de grandes moléculas de ADN atados en superficies de vidrio o de talón se ha utilizado para la investigación de las interacciones ADN-proteína, la dinámica de proteínas sobre un sustrato de ADN, 1,2 y física de polímeros. 3,4 Una plataforma para grandes moléculas de ADN de una sola atados tiene unos pocos distinta ventajas en comparación con otros métodos de inmovilización de ADN. 5 en primer lugar, una molécula de ADN grande atado en la superficie tiene una conformación aleatoria bobina natural sin un flujo de cizallamiento, que es de importancia crítica para una proteína de unión a ADN de reconocer su sitio de unión. En segundo lugar, es muy fácil cambiar el entorno químico alrededor de moléculas de ADN para una serie de reacciones enzimáticas en una cámara de flujo. En tercer lugar, un flujo de cizallamiento de microfluidos induce ADN molecular de estiramiento hasta 100% de la longitud del contorno completo, lo cual es muy difícil de lograr con la elongación del ADN enfoques alternativos como la inmovilización superficie 6 y el confinamiento nanochannel. 7 A completamente stretched molécula de ADN también proporciona información de posición que puede ser útil para el seguimiento de los movimientos enzimáticas en el mapa genómico.
Sin embargo, el procedimiento de anclaje del ADN tiene un defecto crítico en que el colorante de intercalación tales como el YOYO-1 por lo general hace que las moléculas de ADN atados a ser fácilmente rotas por la luz de excitación de fluorescencia. En general, las grandes moléculas de ADN tienen que ser teñido con un tinte fluorescente para la visualización en un microscopio fluorescente. Para este fin, otros colorantes de la serie TOTO YOYO-1 o son principalmente usados debido a que estos tintes son fluorescentes solamente cuando se intercalan DNA de doble cadena. 8 Sin embargo, es bien sabido que los bis-intercalantes colorante hace DNA inducida por la luz de foto-escisión porque de la intercalación de fluoróforos. 9 Además, las moléculas de ADN fluorescente manchadas atados en la superficie son más frágiles puesto que los flujos de cizallamiento pueden ejercer fuerzas de rotura en mover libremente moléculas de ADN. Por lo tanto, hemos desarrollado FP-PAD como una novela DNA-tinción de colorante de proteínas para obtener imágenes de grandes moléculas de ADN atados en la superficie. La ventaja de usar FP-DBP es que no causa foto-escisión de las moléculas de ADN al que se une. 10 Además, FP-DBP no aumenta la longitud de contorno de ADN, mientras que los colorantes bis-intercalantes aumentan la longitud de contorno en aproximadamente 33%.
Este método de vídeo introduce el enfoque experimental para la inmovilización de grandes moléculas de ADN a una superficie de PEG-biotina. La figura 1 ilustra los diferentes enfoques de la inmovilización de ADN con extremos romos y extremos pegajosos. Por lo tanto, este método de tinción se puede aplicar a cualquier tipo de molécula de ADN. La figura 2 muestra una representación esquemática del conjunto de cámara de flujo que puede ser controlado por una bomba de jeringa para generar flujos de cizallamiento para estirar las moléculas de ADN, así como para carga química y enzimática soluciones. la Figura 3 muestra micrografías de las moléculas de ADN completamente estirada atados en el PEGylated superficie 11 y se tiñeron con FP-PAD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos una plataforma para la visualización de moléculas largas de ADN con biotina para el anclaje en las superficies. Hemos informado un enfoque para moléculas de ADN atados en una superficie recubierta de proteína de avidina con albúmina de suero bovino biotinilada. 6 En el enfoque anterior, se encontró una cuestión crucial de ADN foto-escisión causado por colorantes bis-de intercalación que manchan moléculas de ADN atado en el superficie. A medida que estos fluoróforos excitados conti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
Materials
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
References
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