Entièrement automatisé centrifuge microfluidique Dispositif pour Ultrasensitive Protein Détection de sang total
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
Plusieurs plates – formes pour le diagnostic de la maladie ont été élaborés à base de matériaux à l' échelle nanométrique 1,2 tels que des nanofils, 3 nanoparticules, 4 nanotubes, 5 et nanofibres (SNF) 6-8. Ces nanomatériaux offrent d'excellentes perspectives dans la conception de nouvelles technologies pour les essais biologiques très sensibles en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques. Par exemple, les nanofibres d'oxyde de zinc mésoporeuse ont été utilisées pour la femtoseconde molaire détection sensible des marqueurs biologiques du cancer du sein. 9 Récemment, des nanomatériaux à base de dioxyde de titane (TiO 2) ont été étudiées pour des applications bioanalytiques 10 compte tenu de leur stabilité chimique, 11 négligeable dénaturation des protéines 12 et de la biocompatibilité. 13 En outre, les groupes hydroxyle sur la surface de TiO 2 faciliter la modification chimique et la liaison covalente de biomolécules. 14,15 modelée TiO2 thin films 16 ou 17 nanotubes de TiO 2 ont été utilisés pour améliorer la sensibilité de la détection d'une protéine cible en augmentant la zone de surface; Cependant, le procédé de fabrication est relativement complexe et nécessite un équipement coûteux. D'autre part, FNs électrofilées bénéficient d'une attention en raison de leur grande surface ainsi que processus simple et la fabrication à faible coût; 18,19 encore, la caractéristique fragile ou lâche du électrofilés TiO 2 mat NF rend difficile à manipuler et intégrer avec des dispositifs microfluidiques. 6,20 par conséquent, les TiO 2 tapis NF ont rarement été utilisés dans des applications bioanalytiques, en particulier celles qui nécessitent des conditions de lavage difficiles.
Dans cette étude, pour surmonter ces limitations, nous avons développé une nouvelle technologie pour le transfert du électrofilés NF Tapis sur la surface d'un substrat cible en utilisant un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche adhésive. Furthermore, nous avons démontré avec succès l'intégration de électrofilée TiO2 NF mats sur un dispositif microfluidique centrifuge en polycarbonate (PC). En utilisant ce dispositif, une détection de haute sensibilité, entièrement automatisé et intégré de la protéine C-réactive (CRP), ainsi que la troponine I cardiaque (cTnI) a été réalisée dans les 30 minutes à partir de seulement 10 pi de sang total. 21 En raison de la combinaison avantages des propriétés de la FN et la plate-forme centrifuge, l'essai ont montré une large plage dynamique de six ordres de grandeur de 1 pg / ml (~ 8 fM) à 100 ng / ml (~ 0,8 pM) avec une limite inférieure de détection de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) pour CRP et une gamme dynamique de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) à 100 ng / ml (~ 4 nM) avec une limite de détection de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) pour cTnI. Ces limites de détection sont ~ 300 et ~ 20 fois plus faible par rapport à leurs résultats ELISA classiques correspondants. Cette technique pourrait être appliquée à la détection de toutes les protéines cibles, avec des anticorps appropriés. Dans l'ensemble, cette coopération de l'appareilULD contribuent grandement au diagnostic in vitro et des essais biochimiques , car il peut détecter des quantités rares de protéines cibles avec une grande sensibilité même de très petites quantités d'échantillons biologiques, par exemple, 10 pl de sang total. Bien que nous ne démontré la détection des protéines sériques par ELISA dans cette étude, la technologie de transfert et l'intégration des électrofilés FNs avec des dispositifs microfluidiques pourrait être appliquée plus largement dans d'autres réactions biochimiques qui nécessitent une grande surface pour une sensibilité de détection élevée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de TiO 2 NF disque intégré est une technique rapide, économique et pratique pour la détection ultrasensible de faible abondance des protéines présentes dans un volume très faible de sang. Cette technique présente l'avantage d'utiliser des volumes d'échantillons de petite taille (10 pi) et se prête à l'analyse de plusieurs échantillons simultanément. Cela fournit un grand potentiel en tant que dispositif de multiplexage de dosage immunologique. Le dispositif a l'avant…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Research Foundation de Corée (NRF) subventions (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), une subvention de la Korean Health Technology R & D Project, Ministère de la Santé et Bien-être (A121994) et IBS-R020-D1 financé par le gouvernement coréen.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
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