האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
מספר פלטפורמות לאבחון המחלה פותחו על בסיס חומרים ננומטריים 1,2 כגון ננו-חוטים, 3 חלקיקים, 4 צינורות, 5 ו nanofibers (NFS) 6-8. ננו אלה מציעים סיכויים מצוינים בעיצוב של טכנולוגיות חדשות עבור bioassays רגיש מאוד בשל המאפיינים physicochemical הייחודיים שלהם. לדוגמא, nanofibers תחמוצת אבץ mesoporous שמש לצורך זיהוי פמטו-הטוחנת הרגיש של סמנים לסרטן השד. 9 לאחרונה, ננו מבוסס על תחמוצת טיטניום (Tio 2) נחקר עבור יישומי bioanalytical 10 בהתחשב היציבות הכימית שלהם, 11 denaturation חלבון זניח , 12 ו biocompatibility. 13 בנוסף, קבוצות הידרוקסיל על פני השטח של Tio 2 להקל שינוי כימי ואת הקובץ המצורף קוולנטי של מולקולות ביולוגיות. 14,15 2 Patterned TIO תיn סרטים 16 או Tio 2 צינורות 17 כבר נוצלו כדי לשפר את רגישות הזיהוי של חלבון המטרה על ידי הגדלת שטח הפנים; עם זאת, תהליך הייצור הוא מורכב למדי ודורש ציוד יקר. מצד השני, NFS electrospun מקבל תשומת לב בגלל שטח הפנים הגבוה שלהם, כמו גם תהליך ייצור פשוט בעלות נמוך; 18,19 עדיין, המאפיין השביר או רופף של מזרן NF electrospun Tio 2 המקשה לטפל לשלב עם מכשירי microfluidic. 6,20 לכן, מחצלות Tio 2 NF נוצלו לעתים רחוקות ביישומי bioanalytical, במיוחד אלה הדורשים תנאי כביסה קשים.
במחקר זה, כדי להתגבר על המגבלות האלה, פיתחנו טכנולוגיה חדשה להעברת electrospun NF מחצלות על פני השטח של כל המצע היעד על ידי ניצול שכבת דבק דקה polydimethylsiloxane (PDMS). Furthermore, יש לנו בהצלחה הראה שילוב של טיו electrospun 2 NF מחצלות על גבי מכשיר microfluidic צנטריפוגלי פוליקרבונט (PC). שימוש במכשיר זה, זיהוי גבוה רגיש, אוטומטי לחלוטין, ומשולב של C-reactive protein (CRP) כמו גם טרופונין הלבבי אני (cTnI) הושג תוך 30 דקות מן רק 10 μL של דם מלא. 21 בשל בשילוב יתרונות של המאפיינים של NFS ואת פלטפורמת צנטריפוגלי, assay הציג טווח דינמי רחב של שישה סדרי הגודל מ 1 pg / ml (~ 8 FM) עד 100 ng / ml (~ 0.8 pM) עם גבול תחתון של זיהוי של 0.8 pg / ml (~ 6 FM) עבור CRP ומגוון דינמי מ -10 pg / ml (~ 0.4 pM) עד 100 ng / ml (~ 4 ננומטר) עם גבול הגילוי של 37 pg / ml (~ 1.5 pM) עבור cTnI. מגבלות זיהוי אלה ~ 300 ו ~ 20-לקפל תחתון בהשוואה לתוצאות ELISA הקונבנציונליות המתאימות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של כל חלבוני יעד, עם נוגדנים מתאימים. בסך הכל, שיתוף המכשיר הזהULD לתרום רבות חוץ גופית אבחון מבחני ביוכימיים כי הוא מסוגל לגלות כמויות נדירות של חלבונים היעד ברגישות רבה גם מכמויות קטנות מאוד של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, 10 μl של דם מלא. למרות שאנחנו רק הוכחנו את זיהוי סרום חלבון באמצעות ELISA במחקר זה, טכנולוגית ההעברה והאינטגרציה של electrospun NFS עם מכשירי microfluidic יכולה להיות מיושמת באופן נרחב יותר בתגובות ביוכימיות אחרות הדורשים שטח פנים גדול עבור רגישות זיהוי גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
את assay על דיסק משולב Tio 2 NF הוא טכניקה מהירה, זולה ונוחה לאיתור הרגיש של חלבונים נמוכים בשפע נוכחים נפח נמוך מאוד של דם. טכניקה זו יש את היתרון של שימוש כרכים מדגם קטן (10 μl) ו ניתנת לניתוח של דגימות מרובות בו זמנית. זה מספק פוטנציאל גדול כהתקן immunoassay ריבוב. המכשיר כול…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי National Research Foundation של קוריאה (NRF) מענקים (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), מענק מטעם R בריאות הטכנולוגיה הקוריאני & D פרויקט, משרד הבריאות והרווחה (A121994) ו IBS-R020-D1 הממומן על ידי ממשלת קוריאה.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -. J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. . SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).
- Tickoo, S. . EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
