Helautomatiska centrifugala mikroflödessystem enhet för Ultraproteindetektion från helblod
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
Flera plattformar för sjukdomsdiagnos har utvecklats baserat på nanomaterial 1,2 såsom nanotrådar, 3 nanopartiklar, 4 nanorör, 5 och nanofibrer (NFS) 6-8. Dessa nanomaterial har goda förutsättningar i utformningen av ny teknik för mycket känsliga bioanalyser på grund av deras unika fysikalisk-kemiska egenskaper. Till exempel har mesoporösa zinkoxidnanofibrer använts för femto-molar känslig detektion av bröstcancer biomarkörer. 9 Nyligen nanomaterial baserade på titandioxid (TiO 2) har utforskats för bioanalytiska applikationer 10 med tanke på deras kemiska stabilitet, 11 försumbar proteindenaturering , 12 och biokompatibilitet. 13 Dessutom hydroxylgrupperna på ytan av TiO 2 lätta kemisk modifiering och kovalent bindning av biomolekyler. 14,15 Mönstrad TiO 2 thin filmer 16 eller TiO 2 nanorör 17 har använts för att öka känsligheten hos ett målprotein detektering genom att öka ytarean; emellertid är tillverkningsprocessen tämligen komplex och kräver dyr utrustning. Å andra sidan, är elektrospunna NF mottagande uppmärksamhet på grund av deras höga yta samt enkel och billig tillverkningsprocess, 18,19 ännu, gör det svårt att hantera den sköra eller lös egenskap hos electrospun TiO 2 NF matta och integreras med mikroflödessystem enheter. 6,20 Därför ades TiO 2 NF mattor sällan används i bioanalytiska tillämpningar, särskilt sådana som kräver hårda tvättförhållanden.
I denna studie, att övervinna dessa begränsningar, har vi utvecklat en ny teknik för överföring av electrospun NF mattor på ytan av något mål substrat genom att använda en tunn polydimetylsiloxan (PDMS) klisterskiktet. furthermore, vi har framgångsrikt visat att integrera electrospun TiO 2 NF mattor på en centrifugal mikroflödessystem enhet gjord av polykarbonat (PC). Med hjälp av denna enhet, var en hög känslig, helt automatiserad och integrerad detektering av C-reaktivt protein (CRP) samt kardiellt troponin I (cTnI) uppnås inom 30 minuter från endast 10 mikroliter helblod. 21 På grund av den kombinerade fördelarna med egenskaperna hos NFS och centrifugal-plattformen, analysen uppvisade ett brett dynamiskt område av sex storleksordningar från 1 pg / ml (~ 8 fM) till 100 ng / ml (~ 0,8 pM) med en lägre detektionsgräns 0,8 pg / ml (~ 6 fM) för CRP och ett dynamiskt område från 10 pg / ml (~ 0,4 pM) till 100 ng / ml (~ 4 nm) med en detektionsgräns på 37 pg / ml (~ 1,5 pM) för cTnI. Dessa detektionsnivåerna vara ~ 300 och ~ 20-faldigt lägre jämfört med deras motsvarande konventionella ELISA-resultat. Denna teknik kan tillämpas för detektering av eventuella målproteiner, med lämpliga antikroppar. Sammantaget denna enhet could hög grad bidra till in vitro-diagnostik och biokemiska analyser eftersom det kan detektera sällsynta mängder målproteiner med stor noggrannhet, även från mycket små mängder av biologiska prover, t ex 10 pl helblod. Även om vi bara visat serumprotein upptäckt med hjälp av ELISA i denna studie, kan överföring och integration teknik electrospun NF med mikroflödessystem enheter tillämpas mer allmänt i andra biokemiska reaktioner som kräver en stor yta för hög detektionskänslighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen på TiO 2 NF integrerad skiva är en snabb, billig och bekväm teknik för ultra detektering av mycket små mängder proteiner som förekommer i mycket låga volymen av blod. Denna teknik har fördelen av användning av små provvolymer (10 | il) och är mottaglig för analys av flera prover samtidigt. Detta ger en stor potential som en multiplexering immun enhet. Anordningen har den ytterligare fördelen att den inte kräver provförbehandlingssteg såsom plasmaseparation, som erfordras i konvention…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), ett bidrag från den koreanska Health Technology R & D Project, Ministry of Health & Welfare (A121994) och IBS-R020-D1 finansieras av den sydkoreanska regeringen.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -. J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. . SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).
- Tickoo, S. . EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
