La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
Las endosporas son metabólicamente inactivos formas de bacterias que permiten a las bacterias persisten en ambientes desfavorables. En muchas bacterias formadoras de esporas, la formación de esporas es inducida por la privación de nutrientes, pero este proceso puede ser controlado por los cambios en pH, la exposición a oxígeno o otros factores de estrés 1. Si bien en su forma de esporas metabólicamente inactivos, las bacterias se resisten a la radiación UV, desecación, temperaturas más altas, y la congelación de 2. La mayor parte del conocimiento sobre el proceso de esporulación proviene de estudios en el organismo modelo, Bacillus subtilis. El proceso de esporulación comienza con la replicación del ADN y la formación de un 3,4 filamento axial. Un tabique asimétrico luego se divide la célula en dos compartimientos de tamaño desigual. El compartimiento más grande, la célula madre, envuelve el compartimento más pequeño, el preespora. Tanto la célula madre y preespora coordinar la expresión de genes para madurar la espora y la célula madre, finalmente, lisa, de soltar el Dormant de esporas en el medio ambiente que rodea 1.
La estructura y composición de esporas se conserva en muchas especies bacterianas. El núcleo de esporas tiene un contenido de agua inferior a la célula vegetativa y es rica en ácido dipicolínico (DPA) 1,2. Durante la formación de esporas, DPA se bombea en el núcleo de esporas a cambio de agua. Que rodea el núcleo es una membrana de esporas interior donde, en la mayoría de las bacterias formadoras de esporas, los receptores que reconocen las pequeñas moléculas que estimulan la germinación de semillas en germinación (2) se encuentran. Situado a las afueras de la membrana interior de la espora es una capa de peptidoglicano de la pared celular. Una capa de peptidoglicano especializada (corteza) rodea el peptidoglicano de la pared celular y se compone de muchos de los mismos componentes que el peptidoglicano de la pared celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM)]. Sin embargo, aproximadamente 50% de los residuos NAM en la corteza se han convertido a murámico-δ-lactama 5,6 </sarriba>. Durante la germinación de esporas, estos residuos murámico-δ-lactámicos son reconocidos por las esporas de la corteza enzimas líticas (SCLEs), permitiendo así que la corteza a degradarse (un proceso esencial para completar la germinación), pero no la pared celular. Que rodea la corteza es una membrana externa y varias capas de proteínas de la cubierta 2.
Controlar el proceso de germinación es de importancia crítica para las bacterias formadoras de esporas. La germinación se inicia cuando los receptores germinantes interactúan con sus respectivos semillas en germinación 2. En muchas bacterias formadoras de esporas, estas semillas en germinación son aminoácidos, azúcares, nucleótidos, iones o combinaciones de los mismos 2. C. difficile germinación de las esporas es iniciado por combinaciones de ciertos ácidos biliares, [por ejemplo, ácido taurocólico (TA)] y aminoácidos (por ejemplo, glicina) 7-10. Aunque hay diferencias entre el C. vía la germinación difficile y las vías estudiadas en otra forma esporasbacterias, tales como B. subtilis, común a todos es el requisito absoluto para degradar la corteza de esporas para permitir que una célula vegetativa a crecer a partir de la espora germinada 2,8. La degradación de la corteza se puede lograr por el SCLEs CwlJ / SleB (como se encuentra en B. subtilis) o SLEC (como se encuentra en muchos Clostridia). hidrólisis de la corteza reduce la restricción en la pared celular y la espora. Esto permite una rehidratación completa del núcleo, un paso necesario en la reactivación de muchas de las proteínas necesarias para el metabolismo celular 2.
Cuando las esporas germinan, los cambios de esporas inactivas de un estado de fase-brillante a un estado de fase-oscuro y este proceso se pueden medir por un cambio en la densidad óptica (DO) a 600 11 nm. Un informe anterior sugiere que gran parte de este cambio en OD es debido a la liberación de la DPA de la espora 12. Durante nuestra reciente estudio, hemos tratado de comparar el tiempo de C. difficile germinación de esporas y seguimiento de laliberación de la DPA y la corteza fragmentos 9. Para este estudio era fundamental para controlar la liberación de fragmentos de la corteza, ya que comenzó a ser liberado por la germinación de las esporas.
El ensayo colorimétrico se utiliza aquí se basa en un método para la detección de azúcares reductores con extremos desarrollaron Ghuysen et al. 13. Debido a que otros han descrito protocolos para la detección de azúcares reductores 14 o han modificado los protocolos 15, la literatura sobre este tema puede ser confuso. Aquí, un método paso a paso que detalle para la detección colorimétrica de azúcares reductores liberados de la germinación de C. esporas difficile. Aunque este estudio utiliza C. esporas difficile, los azúcares reductores liberados durante la germinación de esporas de otras bacterias formadoras de esporas son capaces de ser detectadas con este protocolo 9,16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tras la estimulación, las esporas se someten el proceso de germinación pierden sus propiedades de resistencia sin la necesidad de la síntesis macromolecular. Cuando se activa la germinación de esporas, el núcleo de esporas de prensa DPA, a cambio de agua 2. Debido al alto contenido de DPA de la espora latente, el núcleo de esporas está bajo presión osmótica intenso y el peptidoglicano especializada, corteza, ayuda a prevenir el núcleo de la hinchazón actuando, presumiblemente, como una barrera a la…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto descrito es apoyado por el premio número 5R01AI116895 del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas o los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
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