Клетки , растущие в трехмерной (3-D) среды представляют собой значительное улучшение по сравнению с выращиванием клеток в 2-D средах (например, колбах или блюда). Здесь мы опишем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, культивируемых в условиях микрогравитации, представленной вращающейся стенки сосуда (RWV) биореакторах.
Поскольку клетки растут в трехмерной (3-D) среде имеют потенциал для преодоления многих пробелов культивирования клеток в 2-D средах (например., Колбах или блюда). На самом деле, широко признается, что клетки, выращенные в колбах или блюда, как правило, де-дифференцироваться и теряют специализированные особенности тканей, из которых они были получены. В настоящее время существует в основном два типа систем культивирования 3-D, где клетки высевают в каркасах, имитирующие нативную внеклеточного матрикса (ECM): (а) статические модели и модели (б) с использованием биореакторов. Первый прорыв был статические модели 3-D. 3-D модели, использующие биореакторы, такие как вращающейся стенки-сосуда (RWV) биореакторы являются более недавнее развитие. Первоначальная концепция RWV биореакторов была разработана в Космическом центре имени Джонсона НАСА в начале 1990-х годов и, как полагают, чтобы преодолеть ограничения статических моделей, таких как развитие гипоксических, некротических ядер. В RWV биореакторов может обойти тысявляется проблемой, обеспечивая гидродинамику, которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода. Эти биореакторы состоят из вращающей базы , которая служит для поддержки и вращения двух различных форматов культуры судов , которые отличаются по типу источника аэрации: (1) Slow Turning Боковые Сосуды (STLVs) с коаксиальным оксигенаторе в центре, или (2 ) Коэффициент сосудов высокого Aspect (HARVs) с оксигенации при помощи плоского, силиконового каучука газообмена мембраны. Эти суда позволяют эффективную передачу газа, избегая образования пузырьков и последующее турбулентность. Эти условия приводят к ламинарного потока и минимальным усилием сдвига, что модели пониженной гравитации (микрогравитации) внутри сосуда для культивирования. Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, культивируемых в условиях микрогравитации, предоставленной RWV биореакторе. </ Р>
Первый прорыв в построении модели 3-D сообщалось в начале 1980 – х , когда ученые начали исследовать различные типы эшафоте (например., Ламинин, коллаген типа I, коллаген IV, и фибронектин) и коктейли факторов роста для улучшения от клетки к клетке и ECM взаимодействий "статических" 3-D модели 1-7. С тех пор, основная проблема с этими моделями были ограничения в передаче питательных веществ и кислорода внутри среды и тканевых конструкций 8. В отличие от клеток в окружающую среду в естественных условиях , которая получает постоянный поток питательных веществ и кислорода из окружающих сетей кровеносных сосудов, статическая природа этих моделей препятствует эффективному распределению их к клеткам. Например, клеточные агрегаты , образующиеся в статических моделях в пробирке , которые превышают размером в несколько миллиметров неизбежно будет развиваться гипоксические, некротические ядра 9. В RWV биореакторов может обойти эту проблемуобеспечивая гидродинамику , которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода 10-12. Тем не менее, на сегодняшний день работы с использованием RWV биореакторов были ограничены включением одного или двух типов клеток 13-17. К тому же, вместо пространственной ориентации, подобной нативных тканей, эти клетки образуются клеточные агрегаты. Основной причиной этих ограничений является отсутствие лески, способного включать клетки комплексно. Леса , используемые в RWV биореакторах на сегодняшний день состоят, с некоторыми исключениями 16-18, в основном из синтетических микросфер, трубчатых цилиндров или небольших листов 13-15,19-23. Эти жесткие материалы, состав и гибкость не может манипулировать, и к которым клетки прикрепляются к их поверхности. Таким образом, маловероятно , что эти модели будут обеспечивать систему , в которой , чтобы оценить, в интегрированной форме, различные клеточные компоненты , такие как стромальные клетки (например., Фибробласты, иммунные и эндотелиальные клетки) , что should быть рассредоточены в эшафот, чтобы точно имитировать ткани человека.
Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека , состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов 24. Эти клетки культивировали в условиях микрогравитации, отданных RWV биореакторе 13,25-30. В нашем 3-D модели, ЕСМ обладает многими различными свойствами, такими как осмотическое давление , подобной культуральной среды (например., Незначительные диффузионные удерживающие устройства во время культивирования) и способностью включать клетки и другие соответствующие белки внеклеточного матрикса, а также как соответствующая жесткость для использования в биореакторах 24. Биологические системы очень сложны, и в течение последних нескольких лет наблюдается сдвиг в фокусе исследований через слизистую оболочку в направлении изучения клеточных взаимодействий с их окружением, а не изучать их в isolatioп. В частности, важность межклеточных взаимодействий в оказании влияния на выживание кишечника и дифференцировки клеток хорошо документирован 31-34. В частности, связь между эпителиальными клетками и их нишей оказывает глубокое влияние на расширение эпителиальных клеток и дифференцировки 35. В самом деле, широко признается, что не только от клетки к клетке, но и клетка-ECM взаимодействия имеют решающее значение для поддержания и дифференцировки эпителиальных клеток в моделях 3-D культуры. Предыдущие исследования показали , что кишка ECM белки , такие как коллаген I 24,36,37, ламинин 38 и фибронектин 39 играют важную роль в оказании влияния на эпителиальные клетки кишечника приобрести пространственную ориентацию , подобную нативной слизистую оболочку. Таким образом, разработка новых технологий, как наш 3-D модели 24, которая может имитировать требуется фенотипическое разнообразие кишечника , если исследователи намерены воссоздать сложную клеточную и структурную архитектуруи функции кишечника микросреды. Эти модели представляют собой важный инструмент в разработке и оценке новых препаратов и оральных вакцин-кандидатов.
В этой рукописи мы опишем развитие биоинженерного модели слизистой оболочки кишечника человека , состоящего из типов клеток , включая кратные первичных человеческих лимфоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток, а также эпителиальным клеткам кишечника линии 24. В этом 3-D моде?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Insulin | Sigma | I-6634 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |