תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) מייצגים שיפור ניכר לעומת טיפוח התא בסביבות 2-D (למשל, צלוחיות או מנות). כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי אדם מתורבת במיקרוגרבטיציה הניתנים על ידי החלפה-קיר-כלי (RWV) bioreactors.
מכיוון תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) יש פוטנציאל לגשר על פערים רבים בטיפוח התא בסביבות 2-D (למשל., צלוחיות או מנות). למעשה, זה זוכה להכרה רחבה כי תאים שגודלו צלוחיות או מאכלים נוטים דה להבדיל ולאבד תכונות מיוחדות של הרקמות שמהם הופקו. נכון לעכשיו, יש בעיקר שני סוגים של מערכות תרבות 3-D שבו התאים הם זורעים לתוך פיגומים מחקו את תאי מטריקס הילידים (ECM): (א) מודלים סטטיים (ב) מודלים באמצעות מתקני גידול. פריצת הדרך הראשונה הייתה 3-D מודלים סטטיים. מודלי 3-D באמצעות מתקני גידול כגון קיר-סיר המסתובב (RWV) bioreactors הם התפתחות מאוחרת יותר. הרעיון המקורי של bioreactors RWV פותחה במרכז החלל ג'ונסון של נאס"א בתחילת 1990 והוא האמין להתגבר על המגבלות של מודלים סטטיים כגון פיתוח של חוסר חמצן, ליבות נמקי. Bioreactors RWV עלול לעקוף הבעיה על ידי מתן דינמיקה של נוזלים המאפשרות דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן היעיל. הגידול האלה מורכב בסיס מסובב המשמש לתמיכה ולסובב בשני פורמטים שונים של כלי תרבות שונות לפי סוג מקור האוורור שלהם: (1) איטי כלי Lateral מפנה (STLVs) עם oxygenator קואקס במרכז, או (2 כלי יחס ממדים גבוהים) (HARVs) עם חמצון באמצעות קרום העברת גז שטוח, גומי סיליקון. כלים אלה מאפשרים מעבר של גז יעיל תוך הימנעות היווצרות בועה והטורבולנטיות סוגרת. תנאים אלה לגרום זרימה למינרית וכוח גזירה מינימלי שמודלים מופחת הכבידה (כבידה) בתוך כלי התרבות. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי האנושית המורכבת קו תא אפיתל מעי לימפוציטים אדם מן המעלה ראשון, תאי האנדותל פיברובלסטים מתורבתים במיקרוגרבטיציה שמספק bioreactor RWV. </ P>
פריצת הדרך הראשונה בבניית מודל 3-D מדווח מוקדם של 1980, כאשר מדענים החלו לחקור סוגים שונים של הפיגום (למשל., Laminin, אני סוג קולגן, קולגן IV, ו פיברונקטין) וקוקטיילים של גורמי גדילה כדי לשפר תא אל תא אינטראקציות ECM של "סטטי" 3-D מודלי 1-7. מאז, הבעיה העיקרית עם המודלים האלה כבר מגבלות בהעברת חומרי מזון וחמצן בתוך מבנים בינוני ורקמות 8. בניגוד תאים בסביבה vivo שמקבלת זרימה קבועה של חומרי מזון וחמצן מן סובבי רשתות של כלי דם, האופי סטטי של מודלים אלה מעכב את ההפצה היעילה של אותם התאים. לדוגמה, אגרגטים התא שנוצר במודלים במבחנה סטטי החורגות כמה מילימטרים בגודל תמיד יפתחו היפוקסי, ליבות נמקי 9. Bioreactors RWV עלול לעקוף בעיה זועל ידי מתן דינמיקה של נוזלים המאפשרים דיפוזיה יעילה של חומרים מזינים 10-12 חמצן. עם זאת, עד כה, עבודה באמצעות מתקני גידול RWV הייתה מוגבלת הכללת סוגי תאים אחד או שניים 13-17. יתר על כן, במקום אוריינטציה מרחבית דומה רקמות הילידים, תאים אלה יצרו אגרגטים התא. הסיבה העיקרית המגבלות האלה כבר החוסר של פיגום מסוגל לשלב תאים בצורה משולבת. הפיגומים ששמשו מתקני גידול RWV עד כה מורכבים, עם כמה יוצא מן הכלל 16-18, בעיקר של microbeads הסינטטי, בלוני צינורי או גיליונות קטנים 13-15,19-23. רכב וגמישות אלו הם חומרים נוקשים אשר לא ניתן להשפיע, וכדי שבו תאים מחוברים פני השטח שלהם. לפיכך, אין זה סביר כי מודלים אלה יספקו מערכת שבה להעריך, בצורה משולבת, מרכיבי התאים השונים כגון תאי סטרומה (למשל., פיברובלסטים, תאי מערכת חיסון ואת אנדותל) כי הסעיףhould להיות מפוזר בתוך הפיגום לחקות רקמה אנושית מקרוב.
כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי האנושי מורכב קו תא אפיתל המעי לימפוציטים אדם מן המעלה הראשונה, תאי אנדותל, פיברובלסטים ו 24. תאים אלה היו בתרבית במיקרוגרבטיציה לספק ידי bioreactor RWV 13,25-30. במודל 3-D שלנו, ECM הוא בעל מאפיינים ברורים רבים, כגון osmolality דומה עד בינוני התרבות (למשל., מעצורי diffusional זניחים במהלך התרבות) ואת היכולת לשלב תאים וחלבונים מטריקס רלוונטיים אחרים, כמו גם קשיחות המתאים לשמש bioreactors 24. מערכות ביולוגיות מורכבות מאוד, ובמהלך השנים האחרונות, חלה תזוזה במוקד המחקר רירי לקראת בחינת אינטראקציות תא עם סביבתם ולא לומד אותם isolation. בפרט, את החשיבות של אינטראקציות תאי תאים בהשפעת הישרדות תא מעיים והבחנה מתועדת היטב 31-34. באופן ספציפי, את התקשורת בין תאי אפיתל הנישה שלהם יש השפעה עמוקה על הרחבת תא אפיתל בידול 35. אכן, מקובל כי לא רק תא אל תא, אלא גם תא אל ECM אינטראקציות הן קריטיות התחזוקה וההתמיינות של תאי אפיתל במודלי תרבות 3-D. מחקרים קודמים הראו כי חלבונים במעיים ECM כגון קולגן אני 24,36,37, 38 laminin ו -39 פיברונקטין הם סייעו המשפיעים תאי האפיתל במעי לרכוש התמצאות מרחבית דומה רירית הילידים. לפיכך, הפיתוח של טכנולוגיות חדשות, כמו המודל 3-D שלנו 24, שיכול לחקות את המגוון פנוטיפי של המעי נדרש אם חוקרים מתכוונים לשחזר את האדריכלות הסלולר מבנית המורכבתותפקוד של microenvironment הבטן. מודלים אלה מייצגים כלי חשוב בפיתוח וההערכה של תרופות פומיות חדשות ומועמדי חיסון.
בכתב היד הזה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל bioengineered של רירית המעי האנושי מורכב של סוגי תאים בכפולות כולל לימפוציטים אדם מן המעלה הראשונה, פיברובלסטים, ותאי אנדותל, וכן 24 שורות תאים אפיתל במעי. ב 3-D מודל זה, הם תאים בתרבית בתוך תאי מטריקס עשיר קולגן בתנאים כבידה 24….
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Insulin | Sigma | I-6634 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |