Forbedret Swiss-rullende Teknik for tarmvæv Forberedelse til immunhistokemisk og Immunofluorescerende Analyser
Summary
Nøjagtig identificering og lokalisering af epitelceller langs tarmslimhinde foring er afgørende for at definere forskellige cellelinier. Korrekt billeddannelse af tarmvæv er afgørende for identifikation af protein ekspressionsmønstre med maksimal opløsning. Denne undersøgelse har til formål at afgrænse de optimale metoder og betingelser for forarbejdning mus tarm væv.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
Pattedyrs intestinale epithel omfatter et enkelt lag af søjleformede celler. I tyndtarmen, er de proliferative celler begrænset til krypterne mens differentierede celler besætte villus region. Men fordi der er ingen villi i tyktarmen, er de proliferative celler lokaliseret til bunden af krypterne og differentierede celler optager det øvre område af krypterne. Tarmepitelet undergår hurtig genopfyldning (ca. 3 – 5 dage), der er drevet af kontinuert fordeling af de proliferative celler i krypterne. De proliferative celler i krypter er ikke en homogen befolkning og er yderligere opdelt i stamceller og transit-forstærke (TA) celler 1. Stamcellerne opholde nederst krypten, inden for de første 4 – 5 celler fra selve bunden 2. Den nuværende model understøtter eksistensen af to typer stamceller: krypt basis søjleformede (CBC) stamceller og reserve hvilende stamceller. CBC stem celler er aktivt prolifererende og er markeret med leucin-rige repeat-holdige G-protein koblet receptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 og Achaete Scute-lignende 2 (Ascl2) 5. På den anden side er reserve hvilende stamceller mærkes ved B-celle-specifik Moloney leukæmivirus integration site 1 (Bmi1) 6, mus telomerase revers transkriptase (mTERT) 7, HOP homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-lignende og CAM kinase -lignende 1 (Dclk1) 9, og leucin-rige gentagelser og immunglobulin-lignende domæner 1 (Lrig1) 10. De aktivt prolifererende stamceller giver anledning til TA celler derefter gennemgå yderligere differentiering i absorberende celler (enterocytter) og sekretoriske celler (enteroendocrine, bæger, Paneth, og Tuft celler). Kontinuerlig celledeling i den proliferative zone resulterer i opadgående bevægelse af epitelceller langs krypten-villus aksen indtil de når toppen af villi, hvor de gennemgår apoptose og erløsnes fra overfladen af epitelet. De forskellige typer af intestinale epitelceller er præget af ekspressionen af distinkte proteiner (f.eks kan intestinale slimceller anerkendes ved farvning med antistof mod MUC2 og Paneth celler med antistof mod lysozym). Vi studerer rolle Krüppel-lignende faktorer (KLFs) i homeostase og patobiologien af tarmepitelet 11-13. Resultaterne præsenteres her støtter muligheden for en modificeret schweizisk-rullende teknik er baseret på tidligere undersøgelser af den rolle, Krüppel-lignende faktor 5 (KLF5) i vedligeholdelse af aktivt prolifererende intestinale epitelceller stamceller 14. KLF5 er en zink-finger transkriptionsfaktor, i høj grad udtrykkes i den aktive intestinal stamme og TA celler 12. Tidligere undersøgelser viste, at KLF5 co-udtrykkes med Ki-67, en kendt proliferativ markør i de intestinale krypter.
Den gastrointestinale tr handling er ikke en strukturelt eller funktionelt homogen væv. Tyndtarmen er opdelt i duodenum, jejunum og ileum og tyktarmen i coecum og colon, idet sidstnævnte yderligere opdelt i proksimal, midterste og distale dele. Hver af disse sektioner har unikke histologiske træk og spiller forskellige roller 15. Som sådan kan virkningen af fornærmelser og graden af respons tarmepitelet afhænge regionen studerede væv 16. Derudover forskellige mus stammer demonstrere mangfoldighed af svaret på det histologiske niveau baseret på den type fornærmelse anvendt i undersøgelserne 16. Således sømmer forberedelse væv er nødvendigt at tillade passende histologiske og molekylære analyse af de intestinale væv. Som sådan er den schweizisk-roll teknik tilskud analyse af hele længden af tarmepitelet på én gang og dermed konstaterer velinformerede konklusioner baseret på omfattende information.
e_content "> Den schweiziske-roll teknik blev først nævnt af Magnus 17, og beskrevet i detaljer af Moolenbeck og Ruitenberg og Park et al., som en metode til fremstilling af væv og udføre histologiske analyser af gnaver tarmen 18,19 henholdsvis. Protokollen afgrænset i denne publikation præsenterer en forbedret version af den oprindelige metode, der tillader for rettidig og pålidelig forberedelse væv til diagnostiske formål. denne modificerede teknik gør det muligt for effektive samlinger og udarbejdelse af tarmepitelet for universelt anvendte teknikker, såsom immunhistokemi, immunfluorescens, samt in situ hybridisering (fluorescerende og chromogene 20). Endvidere modificerede vævsprøven fremstillingsmetode anvender let tilgængelige og forholdsvis billige reagenser samtidig med en fremgangsmåde til hurtig vævsfiksering og tillader genvinding af protein, DNA og RNA til yderligere evaluering. taget sammen, this teknik er fremragende til omfattende vurdering af histopatologiske, patologiske, og molekylære funktioner i tarmens epitel.Protocol
Representative Results
Discussion
Den schweiziske rullende teknik er en kraftfuld metode til fremstilling af intestinal væv til histologisk og morfologisk vurdering i stor skala. I modsætning til den tidligere beskrevne Swiss-rullende teknik, som oprindeligt blev udviklet til fremstilling af frosne snit 18,19, proceduren præsenteres her muliggør hurtig tarmvæv forberedelse og fiksering til formalin fiksering og paraffinindlejring (FFPE). Sammenlignet med frosset væv, FFPE væv har meget længere holdbarhed og er den foretrukne form for …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The “Swiss roll”: a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical ‘swiss roll’ method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
