Amélioration Technique Swiss-laminage pour la préparation Intestinal des tissus pour immunohistochimique et immunofluorescence Analyses
Summary
l'identification et la localisation des cellules épithéliales le long de la paroi de la muqueuse intestinale précis sont essentiels pour définir différentes lignées cellulaires. l'imagerie correcte des tissus intestinaux est cruciale pour l'identification des motifs d'expression de protéine avec une résolution maximale. Cette étude vise à définir les méthodes et les conditions optimales pour les tissus intestinaux de traitement de la souris.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
L'épithélium intestinal de mammifère comprend une seule couche de cellules prismatiques. Dans l'intestin grêle, les cellules proliférantes sont confinés dans les cryptes tandis que les cellules différenciées occupent la région de villosités. Cependant, parce qu'il n'y a pas de villosités dans le gros intestin, les cellules proliférantes sont localisées au fond des cryptes et des cellules différenciées occupent la partie supérieure des cryptes. L'épithélium intestinal subit une reconstitution rapide (environ 3-5 jours) qui est entraîné en continu par division des cellules prolifératives dans les cryptes. Les cellules prolifératives des cryptes ne sont pas une population homogène et sont subdivisées en cellules souches et (TA) des cellules de transit-amplification 1. Les cellules souches se trouvent au fond de la crypte, dans les 4 premières – 5 cellules de la très inférieure 2. Le modèle actuel soutient l'existence de deux types de cellules souches: les cellules souches cryptes colonnaire de base (SRC) et les cellules souches quiescentes de réserve. La SRC scellules TEM sont activement prolifèrent et sont marquées par une protéine G contenant de répétition-leucine-riche récepteur couplé 5 (LGR5) 3, olfactomédine 4 (Olfm4) 4 et Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. D'autre part, les cellules souches quiescentes de réserve sont marqués par B Moloney murine site spécifique des cellules de virus de la leucémie d'intégration 1 (Bmi1) 6, la télomérase de la souris transcriptase inverse (mTERT) 7, HOP Homeobox (HopX) 8, Doublecortin-Like Et CAM Kinase -Comme 1 (DCLK1) 9, et riche en leucine répétitions et Immunoglobulin-Like Domains 1 (Lrig1) 10. Les cellules souches qui prolifèrent activement donnent naissance à des cellules TA puis subissent une différenciation en cellules absorbantes (entérocytes) et les cellules sécrétoires (entéro, caliciformes, cellules Paneth et Tuft). la division cellulaire continue dans la zone de prolifération résulte en mouvement vers le haut des cellules épithéliales le long de l'axe crypte-villosité jusqu'à ce qu'ils atteignent le dessus des villosités, où ils subissent l'apoptose et sontmué hors de la surface de l'épithélium. Les différents types de cellules épithéliales intestinales sont marquées par l'expression de protéines distinctes (par exemple, les cellules caliciformes intestinales peuvent être reconnues par coloration avec un anticorps contre les cellules muc2 et Paneth avec un anticorps dirigé contre le lysozyme). Nous étudions le rôle des facteurs Krüppel-like (KLFs) dans l'homéostasie et physiopathologie de l'épithélium intestinal 11-13. Les résultats présentés ici supportant la faisabilité d'une technique de laminage suisse modifiés sont basés sur des études antérieures sur le rôle de facteur semblable à Krüppel 5 (KLF5) dans le maintien de la prolifération active des cellules souches épithéliales intestinales 14. KLF5 est un facteur de transcription à doigt de zinc qui est fortement exprimé dans la tige intestinale active et les cellules 12 TA. Des études antérieures ont démontré que KLF5 est co-exprimé avec Ki-67, un marqueur proliférative connu dans les cryptes intestinales.
Le tr gastro acte est pas un tissu structurellement ou fonctionnellement homogène. L'intestin grêle est subdivisé en le duodénum, le jéjunum et l'iléon et le gros intestin, du caecum et du côlon dans, ce dernier étant en outre divisée en proximale, intermédiaire et distale. Chacune de ces sections a des caractéristiques histologiques uniques et joue des rôles distincts 15. Par conséquent, les effets des injurieux et le degré de la réponse de l'épithélium intestinal peuvent dépendre de la région de tissu étudié 16. En outre, les différentes souches de souris montrent la diversité de la réponse au niveau histologique en fonction du type d'insulte utilisée dans les études 16. Ainsi, digne préparation des tissus est nécessaire pour permettre histologique appropriée et l'analyse moléculaire des tissus intestinaux. En tant que tel, le Swiss-roll subventions de la technique d'analyse de la longueur totale de l'épithélium intestinal en même temps et donc détermine des conclusions bien informées fondées sur des informations complètes.
e_content "> La technique Swiss-roll a été mentionné par Magnus 17, et décrit en détail par Moolenbeck et Ruitenberg et Park et al. comme une méthode pour la préparation de tissus et d' effectuer des analyses histologiques de l'intestin des rongeurs 18,19, respectivement. Le protocole délimitée dans cette publication présente une version améliorée de la méthode originale qui permet pour la préparation des tissus en temps opportun et fiable à des fins de diagnostic. cette technique modifiée permet de collections et de la préparation de l'épithélium intestinal des techniques universellement utilisées, comme l'immunohistochimie, immunofluorescence, ainsi efficaces comme l' hybridation in situ (fluorescente et chromogénique 20). en outre, le tissu modifié spécimen procédé de préparation utilise des réactifs facilement disponibles et relativement peu coûteux , tout en offrant un mode de fixation rapide des tissus et permet la récupération des protéines, de l' ADN et de l' ARN pour une évaluation supplémentaire. Prise ensemble, this technique est excellente pour l'évaluation complète des caractéristiques histopathologiques, pathologiques et moléculaires de l'épithélium intestinal.Protocol
Representative Results
Discussion
La technique de laminage suisse est une méthode puissante pour la préparation de tissu intestinal pour l'évaluation histologique et morphologique sur une grande échelle. Contrairement à la technique de laminage suisse décrit précédemment, qui a été initialement mis au point pour la préparation de coupes congelées 18,19, la procédure présentée ici permet la préparation du tissu intestinal et de fixation rapide pour la fixation au formol et inclusion dans la paraffine (FFPE). Par rapport aux…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
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