Immunohistochemical और Immunofluorescent विश्लेषण के लिए आंतों के ऊतकों तैयारी के लिए स्विस रोलिंग तकनीक में सुधार

Summary

सटीक पहचान और आंतों mucosal अस्तर के साथ उपकला कोशिकाओं का स्थान अलग सेल प्रजातियों को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं। आंतों के ऊतकों के समुचित इमेजिंग अधिकतम संकल्प के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन प्रसंस्करण माउस आंतों के ऊतकों के लिए इष्टतम तरीके और शर्तों को चित्रित करना है।

Abstract

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Introduction

स्तनधारी आंतों उपकला स्तंभ कोशिकाओं की एक परत शामिल हैं। छोटी आंत में, proliferative कोशिकाओं तहखाने तक ही सीमित हैं, जबकि विभेदित कोशिकाओं अंकुर क्षेत्र पर कब्जा। हालांकि, क्योंकि वहाँ बड़ी आंत में कोई विल्ली हैं, proliferative कोशिकाओं तहखाने के नीचे करने के लिए स्थानीय कर रहे हैं और विभेदित कोशिकाओं तहखाने के ऊपरी क्षेत्र पर कब्जा। (- 5 दिनों के बारे में 3) है कि तहखाने के भीतर proliferative कोशिकाओं की निरंतर विभाजन से प्रेरित है आंतों उपकला तेजी पुनःपूर्ति आए। तहखाने के proliferative कोशिकाओं को एक सजातीय आबादी नहीं कर रहे हैं और आगे स्टेम कोशिकाओं और पारगमन amplifying (टीए) कोशिकाओं ¹ में विभाजित कर रहे हैं। बहुत नीचे ² से 5 कोशिकाओं – स्टेम सेल, तहखाना के तल पर रहते हैं पहले 4 के भीतर। रिजर्व मौन स्टेम कोशिकाओं तहखाना आधार स्तंभ (सीबीसी) स्टेम कोशिकाओं और: मौजूदा मॉडल स्टेम कोशिकाओं के दो प्रकार के अस्तित्व का समर्थन करता है। सीबीसी रोंमंदिर की कोशिकाओं को सक्रिय रूप से फैल रहे हैं और leucine अमीर दोहराने युक्त जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 5 (Lgr5) ^3, 4 Olfactomedin (Olfm4) ⁴ और Achaete कछुआ की तरह 2 (Ascl2) ⁵ से चिह्नित कर रहे हैं। दूसरी ओर, रिजर्व मौन स्टेम कोशिकाओं बी सेल विशिष्ट Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस एकीकरण साइट 1 (BMI1) ^6, माउस टेलोमिरेज रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (mTert) ⁷ से चिह्नित कर रहे हैं, हॉप homeobox (Hopx) ^8, Doublecortin की तरह है और सीएएम Kinase की तरह 1 (Dclk1) ^9, और leucine-रिच को दोहराता है और इम्यूनोग्लोबिन-जैसे डोमेन 1 (Lrig1) ^10। सक्रिय रूप से proliferating स्टेम कोशिकाओं को फिर अवशोषण कोशिकाओं (एन्तेरोच्य्तेस) और स्रावी कोशिकाओं (enteroendocrine, जाम, Paneth, और गुच्छा कोशिकाओं) में आगे भेदभाव से गुजरना टीए कोशिकाओं को जन्म दे। proliferative क्षेत्र में सतत कोशिका विभाजन तहखाना-अंकुर अक्ष के साथ उपकला कोशिकाओं के ऊपर आंदोलन में परिणाम है, जब तक वे विल्ली, जहां वे apoptosis से गुजरना और कर रहे हैं के शीर्ष तक पहुँचनेउपकला की सतह से बंद sloughed। आंतों उपकला कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के अलग प्रोटीन (जैसे, आंतों जाम कोशिकाओं लाइसोजाइम के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ Muc2 और Paneth कोशिकाओं के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है) की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। हम homeostasis और आंतों उपकला ^11-13 की pathobiology में Krüppel-जैसे कारकों (KLFs) की भूमिका का अध्ययन। यहाँ प्रस्तुत एक संशोधित स्विस रोलिंग तकनीक की व्यवहार्यता का समर्थन परिणामों Krüppel-जैसे कारक के 5 (KLF5) को सक्रिय रूप proliferating आंतों उपकला स्टेम कोशिकाओं को ¹⁴ के रखरखाव में भूमिका के पिछले अध्ययनों पर आधारित हैं। KLF5 एक जस्ता उंगली प्रतिलेखन कारक है कि अत्यधिक सक्रिय आंतों स्टेम कोशिकाओं और टीए ¹² में व्यक्त किया जाता है। पिछले अध्ययनों से दिखा दिया है कि KLF5 Ki-67, आंतों तहखाने में एक ज्ञात proliferative मार्कर के साथ सह व्यक्त की है।

जठरांत्र टीआर अधिनियम के एक संरचनात्मक रूप से या कार्यात्मक सजातीय ऊतक नहीं है। छोटी आंत के उत्तरार्द्ध आगे समीपस्थ, मध्य, और बाहर भागों में विभाजित के साथ, ग्रहणी, सूखेपन और लघ्वान्त्र और अंधान्त्र और पेट में बड़ी आंत में बांटा गया है। इन वर्गों के प्रत्येक अद्वितीय ऊतकीय सुविधाओं की है और अलग-अलग भूमिकाओं ¹⁵ निभाता है। जैसे, अपमान का प्रभाव और आंतों उपकला की प्रतिक्रिया की डिग्री अध्ययन ऊतक ¹⁶ के क्षेत्र पर निर्भर हो सकता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न चूहों उपभेदों के अध्ययन के ¹⁶ में इस्तेमाल किया अपमान के प्रकार के आधार पर ऊतकीय स्तर पर प्रतिक्रिया की विविधता को प्रदर्शित करता है। इस प्रकार, ऊतक तैयारी करारा उचित ऊतकीय और आंतों के ऊतकों की आणविक विश्लेषण की अनुमति के लिए आवश्यक है। जैसे, एक समय में आंतों उपकला की पूरी लंबाई के स्विस रोल तकनीक अनुदान विश्लेषण और इस प्रकार व्यापक जानकारी के आधार पर अच्छी तरह से वाकिफ निष्कर्ष ascertains।

e_content "> स्विस रोल तकनीक पहले मैगनस ¹⁷ से उल्लेख किया गया था, और Moolenbeck और Ruitenberg और पार्क एट अल द्वारा विस्तार से वर्णन किया। के रूप में ऊतकों की तैयारी कर रहा है और ऊतकीय प्रदर्शन के लिए एक विधि कृंतक आंत ^18,19, क्रमशः। प्रोटोकॉल का विश्लेषण करती है इस प्रकाशन में चित्रित मूल तरीका है कि नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए समय पर और विश्वसनीय ऊतक तैयारी के लिए परमिट की एक उन्नत संस्करण प्रस्तुत करता है। इस संशोधित तकनीक कुशल संग्रह और ऐसे immunohistochemistry, immunofluorescence, साथ ही सर्वत्र इस्तेमाल की तकनीक, के लिए आंतों उपकला की तैयारी के लिए अनुमति देता है सीटू संकरण में (फ्लोरोसेंट और chromogenic ²⁰⁾ के रूप में। इसके अलावा, तैयारी विधि नमूना संशोधित ऊतक आसानी से उपलब्ध है और अपेक्षाकृत सस्ती अभिकर्मकों तेजी से ऊतक निर्धारण करने की एक विधि की पेशकश करते हुए अतिरिक्त मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल करता है और प्रोटीन, डीएनए की वसूली के लिए अनुमति देता है, और आरएनए। लिया एक साथ, थीतकनीक आंतों उपकला की, histopathological रोग, और आणविक सुविधाओं की व्यापक मूल्यांकन के लिए उत्कृष्ट है।

Protocol

1. चूहे चूहों से जुड़े सभी अध्ययनों स्टोनी ब्रूक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया। चूहों एक 0:12 मानव संसाधन प्रकाश अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया। व्?…

Representative Results

immunohistochemical धुंधला के साथ संयोजन में स्विस रोलिंग तकनीक छोटी या बड़ी आंतों के ऊतकों का व्यापक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। एक C57BL / 6 माउस (चित्रा 1) की एक बड़ी आंत के एच एंड ई धुंधला के उदाह?…

Discussion

स्विस रोलिंग तकनीक बड़े पैमाने पर ऊतकीय और रूपात्मक मूल्यांकन के लिए आंतों के ऊतकों की तैयारी के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। पहले से वर्णित स्विस रोलिंग तकनीक है, जो मूल रूप से जमे हुए वर्गों ^18,19 की त?…

Materials

Stainless Steel Dissecting Kits	VWR	25640-002
Decloaking Chamber	Biocare Medical	DC2012
Syringe 10ml	VWR	89215-218
Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid	Simport	M515
Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]	VWR	48311-703
Manual Slide Staining Set	Tissue-Tek/Sakura	4451
Staining Dish Green	Tissue-Tek/Sakura	4456
Staining Dish White	Tissue-Tek/Sakura	4457
24-Slide Slide Holder with Detachable Handle	Tissue-Tek/Sakura	4465
Oven	Thermo Scientific	6243	for baking slides at 65 degree
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000C
Fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse 90i	Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x
PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
Ethanol 200 proof	AAPR	111000200
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Glacial acetic acid	AAPR	281000ACS
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL
Hydrogen peroxide 25% solution in water	ACROS	202465000
10% bufered formalin	Fisher Scientific	22-026-213
Bovine serum fraction V, heat shock	Roche	3116956001
Tween 20	Sigma Aldrich	P7949
Sodium citrate	Fisher Scientific	S279
Gavage needle	VWR	20068-624
Rabbit anti Klf5 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-22797	Dilution 1: 150
Chicken anti EGFP antibody	Millipore	AB16901	Dilution 1: 500
Rabbit anti Ki67 antibody	Biocare Medical	CRM325B	Dilution 1: 500
Mach3 rabbit AP polymer detection kit	Biocare Medical	M3R533L
Warp red chromogen kit	Biocare Medical	WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 mice	Jackson labs	008875
Automated processor	Leica	Leica TP1020