Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza
Summary
accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l'imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l'identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
L'epitelio intestinale di mammifero comprende un singolo strato di cellule colonnari. Nel piccolo intestino, le cellule proliferative sono limitati alle cripte mentre le cellule differenziate occupano la regione villi. Tuttavia, perché non ci sono villi nell'intestino crasso, le cellule proliferative sono localizzati nel fondo delle cripte e cellule differenziate occupano la regione superiore delle cripte. L'epitelio intestinale subisce rifornimento rapido (circa 3 – 5 giorni) che è guidato dalla divisione continua delle cellule proliferative all'interno delle cripte. Le cellule proliferative delle cripte non sono una popolazione omogenea e sono ulteriormente suddivisi in cellule staminali e cellule 1 di transito di amplificazione (TA). Le cellule staminali risiedono sul fondo della cripta, entro i primi 4 – 5 cellule dal fondo 2. L'attuale modello supporta l'esistenza di due tipi di cellule staminali: le cellule staminali cripta base a colonna (CBC) e le cellule staminali quiescenti di riserva. Il CBC sle cellule TEM sono attivamente proliferando e sono contrassegnati da G-proteine repeat-contenenti ricchi di leucina recettore accoppiato 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 e Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5. D'altra parte, le cellule staminali quiescenti di riserva sono etichettati in base al sito B specifici delle cellule Moloney murine leukemia virus integrazione 1 (BMI1) 6, la telomerasi del mouse trascrittasi inversa (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, doublecortin-like e CAM chinasi -Come 1 (Dclk1) 9, e leucina Rich ripetizioni e Immunoglobulina-Come domini 1 (Lrig1) 10. Le cellule staminali proliferano attivamente danno origine a cellule TA poi subire un'ulteriore differenziazione in cellule assorbenti (enterociti) e cellule secretorie (enteroendocrine, calice, cellule Paneth, e Tuft). divisione cellulare continua nella zona proliferativa traduce in movimento verso l'alto delle cellule epiteliali lungo l'asse cripta-villo fino a raggiungere sommità dei villi, dove subiscono apoptosi e sonosloughed dalla superficie dell'epitelio. I diversi tipi di cellule epiteliali intestinali sono contrassegnati mediante l'espressione di proteine distinte (ad esempio, cellule caliciformi intestinali può essere riconosciuto dalla colorazione con anticorpi contro le cellule MUC2 e Paneth con anticorpi contro il lisozima). Studiamo il ruolo dei fattori Krüppel-like (KLFs) nella omeostasi e patobiologia dell'epitelio intestinale 11-13. I risultati qui presentati sostenere la fattibilità di una tecnica Swiss-rolling modificate sono basate su precedenti studi sul ruolo del fattore Krüppel-like 5 (KLF5) nella manutenzione delle attivamente proliferanti cellule staminali epiteliali intestinali 14. KLF5 è un fattore di trascrizione zinc-finger che è altamente espresso nel gambo intestinale attiva e le cellule TA 12. Studi precedenti hanno dimostrato che KLF5 è co-espresso con Ki-67, un marker proliferativa nota nelle cripte intestinali.
La gastrointestinale TR atto non è un tessuto strutturalmente o funzionalmente omogeneo. L'intestino tenue è suddiviso in duodeno, digiuno, ileo e e crasso in cieco e del colon, con quest'ultimo suddiviso in prossimale, centrale, e le porzioni distali. Ognuna di queste sezioni ha caratteristiche istologiche uniche e svolge ruoli distinti 15. Come tali, gli effetti di insulti e il grado della risposta dell'epitelio intestinale possono dipendere regione di tessuto studiato 16. Inoltre, vari ceppi di topi dimostrano la diversità della risposta a livello istologico base al tipo di insulto usato negli studi 16. Così, si addice preparazione dei tessuti è necessario consentire istologica appropriata e analisi molecolare dei tessuti intestinali. Come tale, il Swiss extra analisi tecnica sovvenzioni della lunghezza completa dell'epitelio intestinale in una sola volta e quindi accerta conclusioni ben informati basate su informazioni complete.
e_content "> La tecnica Swiss-rotolo è stato menzionato da Magnus 17, e descritto in dettaglio da Moolenbeck e Ruitenberg and Park et al. come metodo per la preparazione di tessuti e l'esecuzione di analisi istologica del roditore dell'intestino 18,19 rispettivamente. Il protocollo delineato in questa pubblicazione presenta una versione migliorata del metodo originale che permette per la preparazione dei tessuti tempestive e affidabili per scopi diagnostici. questa tecnica modificata permette di collezioni e la preparazione del epitelio intestinale per le tecniche universalmente utilizzati, come immunoistochimica, immunofluorescenza, così efficienti come ibridazione in situ (fluorescente e cromogenico 20). Inoltre, il tessuto modificato provino metodo di preparazione utilizza reagenti facilmente disponibili e relativamente poco costoso, mentre offrono un metodo di fissaggio del tessuto rapida e permette il recupero di proteine, DNA e RNA per valutazione supplementare. Tratto insieme, thitecnica s è eccellente per la valutazione completa delle caratteristiche istopatologiche, patologiche e molecolari del epitelio intestinale.Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica di laminazione svizzero è un metodo efficace per la preparazione di tessuto intestinale per la valutazione istologica e morfologica su larga scala. In contrasto con la tecnica precedentemente descritta Swiss-rotolamento, che è stato originariamente sviluppato per la preparazione delle sezioni congelate 18,19, la procedura qui presentata consente rapida preparazione tessuto intestinale e la fissazione per fissazione in formalina e paraffina (FFPE). Rispetto ai tessuti congelati, tessuto FFPE ha du…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
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