Forbedret Swiss-rullende teknikk for tarmvevet Forberedelse til Immunhistokjemisk og Immunofluorescent Analyser
Summary
Nøyaktig identifikasjon og plassering av epitelceller langs intestinal mucosal fôr er viktig å definere ulike celle linjene. Riktig avbildning av intestinal vev er avgjørende for identifisering av protein uttrykk mønstre med maksimal oppløsning. Denne studien tar sikte på å avgrense de optimale metoder og forhold for prosessering musetarmvevet.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
Pattedyr tarmepitelet omfatter et enkelt lag av søyleceller. I tynntarmen, blir de proliferative cellene begrenset til krypter mens differensierte cellene opptar villus-regionen. Imidlertid, fordi det ikke er noen villi i tykktarmen, er de proliferative cellene lokalisert til bunnen av kryptene og differensierte celler opptar det øvre område av kryptene. Tarmepitelet gjennomgår hurtig etterfylling (ca 3 – 5 dager) som er drevet ved kontinuerlig oppdeling av proliferative celler i kryptene. De proliferative celler av krypter er ikke en homogen populasjon, og er videre delt inn i stamceller og transitt-amplifisering (TA) celler 1. Stamcellene ligge på bunnen av krypten, i løpet av de første 4 – 5 celler fra bunnen 2. Den nåværende modellen støtter eksistensen av to typer stamceller: krypten basen søyle (CBC) stamceller og reserve stille stamceller. CBC stem celler er aktivt prolifererende og er merket med leucine-rik gjenta holdige G-proteinkoblet reseptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 og Achaete scute lignende 2 (Ascl2) 5. På den annen side, er reserve stille stamceller merket med B-celle-spesifikke Moloney murine leukemi virus integrering for 1. (Bmi1) 6, mus telomerase revers transkriptase (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-aktig og CAM Kinase -lignende 1 (Dclk1) 9, og leucin-rich gjentar og immunoglobulin-lignende domener 1 (Lrig1) 10. De aktivt prolifererende stamceller gir opphav til TA cellene deretter gjennomgå ytterligere differensiering i absorberende celler (entero) og sekretoriske celler (enteroendocrine, beger, Paneth, og tuft celler). Kontinuerlig celledelingen i den proliferative sonen resulterer i oppadgående bevegelse av epitelceller langs krypten-villus akse inntil de når toppen av villi, hvor de gjennomgår apoptose og ersloughed av fra overflaten av epitelet. De ulike typene av intestinale epitelceller er preget av uttrykket av ulike proteiner (f.eks, kan tarmslimceller bli gjenkjent av farging med antistoff mot Muc2 og Paneth celler med antistoff mot lysozym). Vi studere rollen til Krüppel-lignende faktorer (KLFs) i homeostase og patobiologi av tarmepitelet 11-13. Resultatene som presenteres her støtter gjennomførbarheten av en modifisert Swiss-valseteknikk er basert på tidligere undersøkelser av rollen til Krüppel-lignende faktor 5 (KLF5) i vedlikehold av aktivt prolifererende intestinale epitelceller stamceller 14. KLF5 er en sink-finger transkripsjonsfaktor som er sterkt uttrykt i aktiv tarm stammen og TA celler 12. Tidligere studier har vist at KLF5 er co-uttrykkes med Ki-67, en kjent proliferativ markør i tarm krypter.
Mage-tr handling er ikke et strukturelt eller funksjonelt homogen vev. Tynntarmen er delt inn i duodenum, jejunum og ileum og tykktarmen inn i cecum og tykktarm, med den sistnevnte videre delt inn proksimale, midtre og distale deler. Hver av disse seksjonene har unike histologiske funksjoner og spiller forskjellige roller 15. Som sådan, kan virkningene av fornærmelser og graden av responsen til tarmepitelet er avhengig av området av undersøkt vev 16. I tillegg er forskjellige musestammer demonstrere mangfold av responsen på det histologiske nivå basert på den type av fornærmelse anvendt i studiene 16. Således som gjenspeiler dette vevspreparatet er nødvendig for å tillate passende histologiske og molekylær analyse av tarmvevet. Som sådan, Swiss-rull teknikk tilskudd analyse av hele lengden av tarmepitelet på en gang og dermed konstaterer velinformerte konklusjoner basert på omfattende informasjon.
e_content "> The Swiss-roll teknikken ble først nevnt av Magnus 17, og beskrevet i detalj av Moolenbeck og Ruitenberg og Park et al. som en metode for å forberede vev og utføre histologisk analyser av gnager tarmen 18,19, henholdsvis. Protokollen skissert i denne publikasjon viser en forbedret versjon av den opprinnelige metode som tillater for presis og pålitelig vev forberedelse for diagnostiske formål. denne modifiserte teknikken gjør det mulig for effektiv samlinger og fremstillingen av tarmepitelet for universelt brukte teknikker, slik som immunhistokjemi, immunfluorescens, såvel som in situ hybridisering (fluorescerende og kromogen 20). Videre er det modifiserte vev prøven fremstillingsmetode utnytter lett tilgjengelige og relativt rimelige reagenser samtidig som de gir en fremgangsmåte for hurtig vev fiksering og gjør det mulig for utvinning av protein, DNA og RNA for ytterligere evaluering. Tatt sammen, this teknikken er utmerket for helhetlig vurdering av histopatologiske, patologiske og molekylære funksjoner i tarmepitelet.Protocol
Representative Results
Discussion
Den sveitsiske rullende teknikken er en kraftig metode for fremstilling av tarmvevet for histologisk og morfologisk vurdering på en stor skala. I motsetning til den tidligere beskrevne Swiss-valseteknikk, som opprinnelig ble utviklet for fremstilling av frosne seksjoner 18,19, fremgangsmåten som presenteres her muliggjør rask tarmvevet forberedelse og fiksering for formalin fiksering og forankring parafin (FFPE). Sammenlignet med frossent vev, har FFPE vev mye lengre holdbarhet og er den foretrukne type ve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The “Swiss roll”: a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical ‘swiss roll’ method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
