Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Summary

A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.

Abstract

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Introduction

O epitélio intestinal de mamífero compreende uma única camada de células colunares. No intestino delgado, as células proliferativas são confinados às criptas enquanto que as células diferenciadas ocupar a região da vilosidade. No entanto, porque não há nenhum vilosidades no intestino grosso, as células proliferativas são localizadas na parte inferior das criptas e células diferenciadas ocupar a região superior das criptas. O epitélio intestinal sofre reposição rápida (cerca de 3-5 dias) que é accionado por divisão contínua das células proliferativas nas criptas. As células proliferativas das criptas não são uma população homogénea e são ainda subdivididas em células estaminais e células-amplificação de trânsito (TA) ^1. As células estaminais reside na parte inferior da cripta, dentro das primeiras 4 – 5 células a partir da parte inferior ^2. O modelo atual suporta a existência de dois tipos de células-tronco: as células-tronco da cripta colunar base (CBC) e de reserva de células estaminais quiescentes. A CBC scélulas dez estão se proliferando de forma activa e são marcados por rica em leucina contendo repetição G-proteína receptor acoplado 5 (Lgr5) ^3, Olfactomedin 4 (Olfm4) ⁴ e Achaete scute-like 2 (Ascl2) ^5. Por outro lado, as células estaminais quiescentes de reserva são rotulados por Moloney site B específico da célula vírus da leucemia murina de integração 1 (Bmi1) ^6, a telomerase rato transcriptase reversa (mTert) ^7, HOP homeobox (Hopx) ^8, duplacortina-like e CAM Kinase -como 1 (Dclk1) ^9, e leucina-ricos repete e do tipo imunoglobulina domínios 1 (Lrig1) ^10. As células estaminais que proliferam activamente dar origem a células TA, em seguida, submetido a posterior diferenciação em células absortivas (enterócitos) e células secretoras (enteroendócrinas, caliciformes, células de Paneth e flocos). divisão celular contínua na zona proliferativa resulta em movimento ascendente de células epiteliais ao longo do eixo de cripta-vilosidade até atingirem a parte superior da vilosidade, onde eles sofrem apoptose e sãodescartadas a partir da superfície do epitélio. Os diferentes tipos de células epiteliais intestinais estão marcados pela expressão de proteínas diferentes (por exemplo, células caliciformes intestinais podem ser reconhecidos através de coloração com anticorpo contra células de Paneth MUC2 e com anticorpo contra lisozima). Nós estudar o papel de factores como Krüppel-(KLFs) na homeostase e patobiologia do epitélio intestinal ^11-13. Os resultados aqui apresentados apoiar a viabilidade de uma técnica de laminagem Swiss modificado baseiam-se em estudos anteriores sobre o papel do factor-Krüppel como 5 (KLF5) na manutenção das proliferam activamente células estaminais epiteliais intestinais ^14. KLF5 é um factor de transcrição dedo de zinco que é altamente expresso na haste intestinal activa e ¹² alvéolos Ta. Estudos anteriores demonstraram que KLF5 é co-expressa com Ki-67, um marcador conhecido proliferativa nas criptas intestinais.

O tr gastrointestinal ato não é um tecido estruturalmente ou funcionalmente homogénea. O intestino delgado é dividido em duodeno, jejuno e íleo e o intestino grosso no ceco e no cólon, com esta última ainda divididas em segmentos proximal, médio e distal. Cada uma destas secções tem características histológicas únicas e desempenha papéis distintos ^15. Como tal, os efeitos de insultos e o grau de resposta do epitélio intestinal pode depender da região de tecido estudado ^16. Além disso, várias estirpes de ratos demonstrar a diversidade da resposta ao nível histológico com base no tipo de insulto utilizado nos estudos ^16. Assim, condizente com a preparação do tecido é necessário para permitir histológico apropriado e análise molecular dos tecidos intestinais. Como tal, a-rolo suíço análise bolsas técnica de todo o comprimento do epitélio intestinal de uma só vez e, assim, verifica conclusões bem informadas com base numa informação global.

e_content "> A técnica Swiss-rolo foi mencionado pela primeira vez por Magnus ^17, e descrito em detalhe por Moolenbeck e Ruitenberg e Park et al., como um método para a preparação de tecidos e realizando análises histológicas do intestino roedor ^18,19, respectivamente. O protocolo delineada na presente publicação apresenta uma versão melhorada do método original que permite a preparação do tecido oportuna e confiável para fins de diagnóstico. esta técnica modificada permite coleções e preparação do epitélio intestinal de técnicas universalmente utilizados, tais como imuno-histoquímica, imunofluorescência, bem eficientes como hibridação in situ (fluorescente e cromogénico ^20). Além disso, o tecido modificado espécime método de preparação utiliza reagentes facilmente disponíveis e relativamente pouco dispendiosos, enquanto que oferecem um método de fixação rápida dos tecidos e permite a recuperação de proteína, ADN e ARN para a avaliação adicional. Tomados juntos, this técnica é excelente para avaliação abrangente dos aspectos histopatológicos, patológicas e moleculares do epitélio intestinal.

Protocol

1. Ratos Todos os estudos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Stony Brook University (IACUC). Os ratinhos foram mantidos num ciclo de luz-escuro 12:12 h. Comercialmente obter ratinhos C57BL / 6. Obter camundongos C57BL / 6 com alelos Klf5 flanqueadas por locais loxP (Klf5 f l / f l). Estes ratos foram previamente descritos 21 e graciosamente cedido pelo Dr. Ryozo Nagai. </li…

Representative Results

A técnica de rolamento suíça em combinação com coloração imuno-histoquímica permite a análise abrangente do tecido intestinal pequeno ou grande. O exemplo de coloração de H & E de um intestino grosso de um C57BL / 6 de ratinho (Figura 1) é uma ilustração da exequibilidade e a eficácia desta técnica. Como mostrado na Figura 1, a imagem é capaz de capturar todas as porções do cólon: proximal, médio e distal. Assim,…

Discussion

A técnica de laminação Swiss é um método poderoso para a preparação de tecido intestinal para avaliação histológica e morfológica em grande escala. Em contraste com a técnica Swiss-laminagem anteriormente descrita, que foi originalmente desenvolvido para preparação de secções congeladas ^18,19, o processo aqui apresentado permite a preparação do tecido intestinal rápida e a fixação para a fixação de formalina e embebidos em parafina (FFPE). Em comparação com tecido congelado, o tecido …

Materials

Stainless Steel Dissecting Kits	VWR	25640-002
Decloaking Chamber	Biocare Medical	DC2012
Syringe 10ml	VWR	89215-218
Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid	Simport	M515
Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]	VWR	48311-703
Manual Slide Staining Set	Tissue-Tek/Sakura	4451
Staining Dish Green	Tissue-Tek/Sakura	4456
Staining Dish White	Tissue-Tek/Sakura	4457
24-Slide Slide Holder with Detachable Handle	Tissue-Tek/Sakura	4465
Oven	Thermo Scientific	6243	for baking slides at 65 degree
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000C
Fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse 90i	Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x
PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
Ethanol 200 proof	AAPR	111000200
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Glacial acetic acid	AAPR	281000ACS
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL
Hydrogen peroxide 25% solution in water	ACROS	202465000
10% bufered formalin	Fisher Scientific	22-026-213
Bovine serum fraction V, heat shock	Roche	3116956001
Tween 20	Sigma Aldrich	P7949
Sodium citrate	Fisher Scientific	S279
Gavage needle	VWR	20068-624
Rabbit anti Klf5 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-22797	Dilution 1: 150
Chicken anti EGFP antibody	Millipore	AB16901	Dilution 1: 500
Rabbit anti Ki67 antibody	Biocare Medical	CRM325B	Dilution 1: 500
Mach3 rabbit AP polymer detection kit	Biocare Medical	M3R533L
Warp red chromogen kit	Biocare Medical	WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 mice	Jackson labs	008875
Automated processor	Leica	Leica TP1020