Mejora Técnica Swiss-laminación para la preparación del tejido intestinal para inmunohistoquímica y análisis de inmunofluorescencia
Summary
La identificación exacta y la ubicación de las células epiteliales a lo largo del revestimiento de la mucosa intestinal son esenciales para definir diferentes linajes celulares. de formación de imágenes adecuado de los tejidos intestinales es crucial para la identificación de patrones de expresión de proteínas con la máxima resolución. Este estudio tiene como objetivo delinear los métodos y condiciones óptimas para el procesamiento de tejidos intestinales de ratón.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
El epitelio intestinal de mamíferos comprende una única capa de células columnares. En el intestino delgado, las células proliferativas se limitan a las criptas mientras que las células diferenciadas ocupan la región de las vellosidades. Sin embargo, porque no hay vellosidades en el intestino grueso, las células proliferativas se localizan en la parte inferior de las criptas y células diferenciadas ocupan la región superior de las criptas. El epitelio intestinal se somete a la reposición rápida (aproximadamente 3 – 5 días) que es impulsado por la división continua de las células proliferativas en las criptas. Las células proliferativas de las criptas no son una población homogénea y se subdividen en células madre y células de tránsito de amplificación (TA) 1. Las células madre residen en la parte inferior de la cripta, dentro de los primeros 4 – 5 células de la parte inferior 2. El modelo actual apoya la existencia de dos tipos de células madre: células madre de las criptas columnar base (CBC) y las células madre latentes de reserva. El CBC stem células proliferan activamente y están marcados por la proteína G que contiene la repetición rica en leucina-receptor acoplado a 5 (LGR5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 y Achaete escudo 2 similar (ascl2) 5. Por otro lado, las células madre latentes de reserva están etiquetados por B sitio específico de la célula murina de Moloney virus de la leucemia de integración 1 (Bmi1) 6, la telomerasa de ratón transcriptasa inversa (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-like y CAM quinasa -Como 1 (Dclk1) 9, y ricos en leucina repite y dominios similares a inmunoglobulina 1 (LRIG1) 10. Las células madre proliferan activamente dan lugar a células TA entonces someterse a una diferenciación en células de absorción (enterocitos) y células secretoras (enteroendocrinas, caliciformes, células Paneth y Tuft). la división celular continua en la zona de proliferación resulta en el movimiento hacia arriba de las células epiteliales a lo largo del eje cripta-vellosidad hasta que llegan a la parte superior de las vellosidades, donde se someten a apoptosis y sondesprendido de la superficie del epitelio. Los diferentes tipos de células del epitelio intestinal se caracterizan por la expresión de proteínas distintas (por ejemplo, células caliciformes intestinales pueden ser reconocidos por la tinción con anticuerpo contra las células de Paneth y Muc2 con anticuerpo contra lisozima). Se estudia el papel de Krüppel-como factores (KLFs) en la homeostasis y patobiología del epitelio intestinal 11-13. Los resultados presentados aquí el apoyo a la viabilidad de una técnica de Swiss-balanceo modificado se basan en estudios anteriores de la función de factor de Krüppel-como 5 (KLF5) en el mantenimiento de las células madre epiteliales intestinales proliferación activa 14. KLF5 es un factor de transcripción con dedo de zinc que está altamente expresado en el tallo intestinal activa y células TA 12. Estudios anteriores demostraron que KLF5 es co-expresada con Ki-67, un marcador de proliferación conocido en las criptas intestinales.
El tr gastrointestinal acto no es un tejido homogéneo estructural o funcionalmente. El intestino delgado se divide en el duodeno, el yeyuno y el íleon y el intestino grueso en ciego y colon, con este último aún más dividido en proximal, media y distal. Cada una de estas secciones tiene características histológicas únicos y desempeña funciones distintas 15. Como tal, los efectos de insultos y el grado de la respuesta del epitelio intestinal puede depender de la región de tejido estudiado 16. Además, varias cepas de ratones demuestran la diversidad de la respuesta a nivel histológico basado en el tipo de insulto utilizado en los estudios 16. Por lo tanto, como corresponde a la preparación del tejido es necesaria para permitir histológico apropiado y el análisis molecular de los tejidos intestinales. Como tal, el suizo-line subvenciones técnica de análisis de la longitud completa del epitelio intestinal a la vez y por lo tanto verificaba conclusiones bien informadas sobre la base de una información completa.
e_content "> La técnica Swiss-rodillo se mencionó por primera vez por Magnus 17, y se describe en detalle por Moolenbeck y Ruitenberg y Park et al., como un método para preparar los tejidos y la realización de análisis histológicos del intestino roedor 18,19, respectivamente. El protocolo delineado en esta publicación presenta una versión mejorada del método original que permite para la preparación del tejido a tiempo y fiable para fines de diagnóstico. esta técnica modificada permite para las colecciones y preparación del epitelio intestinal de técnicas utilizadas universalmente, como la inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, así eficientes como la hibridación in situ (fluorescente y cromogénico 20). Además, el tejido modificado espécimen método de preparación utiliza reactivos fácilmente disponibles y relativamente baratos, mientras que ofrecen un método de fijación del tejido de rápida y permite la recuperación de la proteína, ADN, y ARN para la evaluación adicional. Tomado juntos, this técnica es excelente para la evaluación completa de las características histopatológicas, patológicos y moleculares del epitelio intestinal.Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica de laminación Swiss es un método poderoso para la preparación de tejido intestinal para la evaluación histológica y morfológica en gran escala. En contraste con la técnica de Swiss-laminación anteriormente descrito, que fue desarrollado originalmente para la preparación de secciones congeladas 18,19, el procedimiento que aquí se presenta permite la preparación del tejido intestinal rápido y fijación para la fijación con formalina y la incrustación de parafina (FFPE). En comparación…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
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