Förbättrad Swiss-rullande Teknik för tarmvävnad Förberedelse för immunhistokemisk och immunofluorescens Analyser
Summary
Korrekt identifiering och lokalisering av epitelceller längs tarmslemhinnans lining är väsentliga för att definiera olika cellinjer. Korrekt avbildning av tarmvävnad är avgörande för identifiering av proteinuttrycksmönster med maximal upplösning. Denna studie syftar till att beskriva de optimala metoder och villkor för bearbetning mus tarmvävnader.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
Däggdjurens tarmepitel innefattar ett enda skikt av kolumnära celler. I tunntarmen, är de proliferativa cellerna begränsade till kryptor medan differentierade celler ockupera villus regionen. Men eftersom det inte finns några villi i tjocktarmen, är proliferativa celler lokaliserade till botten av kryptor och differentierade celler upptar den övre delen av kryptor. Tarmepitelet genomgår snabb påfyllning (ca 3-5 dagar) som drivs genom kontinuerlig uppdelning av proliferativa celler i kryptor. De proliferativa celler i kryptorna är inte en homogen befolkning och är indelade i stamceller och transitförstärkande (TA) celler 1. Stamcellerna uppe vid botten av kryptan, inom de första 4 – 5 celler från mycket botten 2. Den nuvarande modellen stöder förekomsten av två typer av stamceller: crypt bas columnar (CBC) stamceller och reserv vilande stamceller. CBC stem-celler är aktivt prolifererande och är markerade med leucin-rika repeteinnehållande G-proteinkopplad receptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 och Achaete scute liknande 2 (Ascl2) 5. Å andra sidan, är reserv vilande stamceller märkt genom B-cell-specifika Moloney murint leukemivirus integrationsstället ett (Bmi1) 6, mus telomeras omvänt transkriptas (mTERT) 7, HOP homeobox (Hopx) 8, Doublecortin-liknande och CAM Kinase -liknande 1 (Dclk1) 9, och leucinrika upprepar och immunoglobulinliknande domäner 1 (Lrig1) 10. De aktivt prolifererande stamceller ger upphov till TA-celler sedan genomgå ytterligare differentiering i absorberande celler (enterocyter) och sekretoriska celler (enteroendocrine, bägare, Paneth och tofs celler). Kontinuerlig celldelning i proliferativa zonen resulterar i en rörelse uppåt av epitelceller längs kryptan-villus axeln tills de når toppen av villi, där de genomgår apoptos och ärfaller av från ytan av epitelet. De olika typerna av intestinala epitelceller markeras genom uttryck av olika proteiner (t.ex. kan tarm bägarceller erkännas genom färgning med antikroppar mot Muc2 och panethceller med antikropp mot lysozym). Vi studerar roll Krüppel-liknande faktorer (KLFs) i homeostas och patobiologi av tarmepitelet 11-13. De resultat som presenteras här stödjer genomförbarheten av en modifierad Swiss-rullande teknik bygger på tidigare studier av den roll som Krüppel liknande faktor 5 (KLF5) i upprätthållandet av aktivt prolifererande intestinala epitelceller stamceller 14. KLF5 är en zinkfingertranskriptionsfaktor som uttrycks i hög utsträckning i den aktiva intestinal stam och TA cellerna 12. Tidigare studier har visat att KLF5 samuttrycks med Ki-67, en känd proliferativ markör i tarm kryptor.
Mag tr handlingen är inte strukturellt eller funktionellt homogen vävnad. Tunntarmen är uppdelad i tolvfingertarmen, jejunum och ileum och tjocktarmen i blindtarmen och tjocktarmen, med den senare vidare indelade i proximal, mitt och distala delarna. Var och en av dessa sektioner har unika histologiska egenskaper och spelar olika roller 15. Som sådan, kan effekterna av förolämpningar och graden av svaret från tarmepitelet beror på regionen studerade vävnad 16. Dessutom, olika musstammar visa mångfalden av svaret på den histologiska nivå beroende på vilken typ av förolämpning som används i studierna 16. Således, anstår förberedelse vävnad är nödvändigt att möjliggöra en lämplig histologiska och molekylär analys av tarmvävnad. Som sådan, det schweiziska-roll bidrag teknik analys av den fullständiga längden hos tarmepitelet vid en tid och därmed konstaterar välinformerade slutsatser baserade på omfattande information.
e_content "> Den schweiziska-roll teknik nämndes först av Magnus 17, och beskrivs i detalj av Moolenbeck och Ruitenberg och Park et al. som en metod för framställning av vävnader och utföra histologiska analyser av gnagare tarmen 18,19 respektive. Protokollet avgränsas i denna publikation presenterar en förbättrad version av den ursprungliga metoden som tillåter för aktuell och tillförlitlig vävnadspreparat för diagnostiska ändamål. denna modifierade teknik möjliggör effektiva samlingar och framställning av tarmepitelet för allmänt använda tekniker, såsom immunohistokemi, immunofluorescens samt som in situ hybridisering (fluorescerande och kromogena 20). Dessutom modifierade vävnadsprovet framställningsmetod utnyttjar lättillgängliga och relativt billiga reagens samtidigt som den erbjuder en metod för snabb vävnadsfixering och möjliggör återvinning av protein, DNA och RNA för ytterligare utvärdering. Taken tillsammans, this teknik är utmärkt för omfattande utvärdering av histopatologiska, patologiska och molekylära egenskaper hos tarmepitelet.Protocol
Representative Results
Discussion
Den schweiziska rullande teknik är en kraftfull metod för framställning av tarmvävnad för histologisk och morfologisk bedömning i stor skala. I motsats till den tidigare beskrivna Swiss-valsningsteknik, som ursprungligen utvecklades för beredning av frusna sektioner 18,19, det förfarande som presenteras här möjliggör snabb tarmvävnadspreparat och fixering för formalinfixering och paraffininbäddning (FFPE). Jämfört med frusen vävnad, har FFPE vävnad mycket längre hållbarhet och är den vanl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The “Swiss roll”: a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical ‘swiss roll’ method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
