Generatie Parabiotic zebravis embryo's door Surgical Fusion of Developing Blastulae
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
Chirurgische parabiosis van twee dieren van verschillende genetische achtergronden creëert een unieke scenario naar cel-intrinsieke versus cell-extrinsieke rollen voor kandidaat-genen van belang, migrerende gedrag van cellen en uitgescheiden signalen in verschillende genetische instellingen te bestuderen. Omdat parabiotic dieren een gemeenschappelijke circulatie, zal geen bloed of bloed overdraagbare factor van het ene dier worden uitgewisseld met zijn partner en vice versa. Aldus kunnen cellen en moleculaire factoren afgeleid van één genetische achtergrond worden onderzocht in de context van een tweede genetische achtergrond. Parabiosis van volwassen muizen wordt veelvuldig gebruikt voor onderzoek veroudering, kanker, diabetes, obesitas, en hersenontwikkeling. Meer recent is parabiosis zebravis embryo gebruikt om de ontwikkelingsbiologie van hematopoiese bestuderen. In tegenstelling tot muizen, de transparantie van zebravisembryo's maakt de directe visualisatie van cellen in de context parabiotic, waardoor het een uniek krachtige methode voor het onderzoeken fundamental cellulaire en moleculaire mechanismen. De bruikbaarheid van deze techniek wordt echter beperkt door een steile leercurve voor het genereren van de parabiotic zebravisembryo's. Dit protocol wordt stap voor stap methode voor het operatief smelten de blastulae twee zebravis embryo's van verschillende genetische achtergronden van de rol van kandidaatgenen plaats onderzoeken. Bovendien, de parabiotic zebravis embryo tolerant hitteschok, waardoor temporele regulatie van genexpressie mogelijk. Deze methode vereist geen geavanceerde set-up en heeft brede toepassingen voor het bestuderen van celmigratie, het lot specificatie, en differentiatie in vivo tijdens de embryonale ontwikkeling.
Introduction
Oprichting van genetische mozaïeken (chimaera's) tussen wild-type en genetisch gemodificeerde dieren is een gevestigde en klassieke strategie voor het onderzoeken van cel-intrinsieke versus cell-extrinsieke functies van kandidaatgenen 1-6. Blastula transplantatie in zebravis is op grote schaal gebruikt om chimeer embryo voor studies van cel-autonome 7-9 genereren. Afhankelijk van het weefsel van belang, maar het kan lastig zijn om voorspelbaar richten donorcellen het gewenste weefsel (bijvoorbeeld bloed) 1-3, 7-9. Muis genetici hebben lang gebruikt parabiotic chirurgische methoden om samengevoegde organismen te genereren met een gezamenlijke oplage 10-14. Omdat de dieren parabiotic een gemeenschappelijke bloedbaan kunnen interacties tussen cellen die afkomstig zijn van een dier met cellen van de andere dieren van een andere genetische achtergrond te bestuderen 10-16. Onlangs, Karima Kissa de groep elegant aangetoond dat het vermogen om te createn Siamese zebravis embryo's en gebruik van dit systeem om hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cel (HSPC) migratie 15 te bestuderen. Bovendien werd zebravis parabiosis onlangs gebruikt om de rol van endotheliale cadherine 5 in hematopoietische stamcellen (HSC) ontstaan en migratie, 16 onderzoeken en om de rol van stromale cellen in de HSPC niche bestuderen bij zebravis ontwikkeling 17.
In tegenstelling tot muizen, zebravis embryo's transparant zijn en de directe visualisatie van cellen tijdens parabiotic ontwikkeling, waardoor het systeem uniek krachtig. Het nut van parabiosis in de zebravis is echter beperkt door een steile leercurve, en parabiotic een operatie aan de delicate embryo's kunnen technisch uitdagende zonder gedetailleerde instructies en visuele demonstratie. Het doel van dit protocol is om een set van duidelijke, stap-voor-stap instructies voor het video-based tutorials over hoe je parabiotic zebravis embryo's voor het bestuderen van het genereren moet begeleidentemporale, cel-intrinsieke of extrinsieke cel-functies van een kandidaat-gen (en) van chirurgische fusie ontwikkelen blastulae. Belangrijkste wijzigingen en aanvullende aanbevelingen voor het verhogen van parabiont overleven en nieuwe experimentele toepassingen zijn inbegrepen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parabiotic fusie is een krachtig hulpmiddel om cellulaire functies van kandidaatgenen onderzoeken bij volwassen muizen modellen en kippenembryo's 10-14 geweest. Meer recent heeft een blastula fusiemethode beschreven voor het genereren van samengevoegde zebravisembryo's 15. In het huidige protocol, zijn video-based tutorials gebruikt om aan te tonen en een betere beschrijving van de methode voor het maken van parabiotic zebravis embryo's van verschillende genetische achtergronden om tijd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
