Generation Parabiotic Zebrafish embryon genom kirurgisk Fusion utveckla Blastulae
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
Kirurgisk parabiosis av två djur av olika genetisk bakgrund skapar en unik situation för att studera cell inneboende kontra cell yttre roller för gener av intresse, flytt beteenden av celler och utsöndrade signaler i olika genetiska inställningar. Eftersom parabiotic djur delar en gemensam cirkulation, kommer något blod eller blodburen faktorn från ett djur utbytas med sin partner och vice versa. Således kan celler och molekylära faktorer härledda från en genetisk bakgrund att studeras i samband med en andra genetisk bakgrund. Parabiosis av vuxna möss, har varit omfattande forskning åldrande, cancer, diabetes, fetma, och hjärnans utveckling. På senare tid, parabiosis av zebrafisk embryon har använts för att studera utvecklingsbiologi av blodbildningen. Till skillnad från möss, den öppna karaktär zebrafisk embryon medger direkt visualisering av celler i parabiotic sammanhang, vilket gör det unikt kraftfull metod för att undersöka fundamental cellulära och molekylära mekanismer. Användbarheten av denna teknik emellertid är begränsad av en brant inlärningskurva för att generera de parabiotic zebrafiskembryon. Detta protokoll ger en steg-för-steg-metod för att kirurgiskt fusera blastulae av två zebrafisk embryon med olika genetiska bakgrunder för att undersöka rollen av kandidatgener av intresse. Dessutom är de parabiotic zebrafisk embryon är toleranta mot värmechock, vilket gör temporal kontroll av genuttryck möjligt. Denna metod kräver inte en sofistikerad uppsättning upp och har breda applikationer för att studera cell migration, öde specifikation och differentiering in vivo under fosterutvecklingen.
Introduction
Skapande av genetiska mosaiker (chimärer) mellan vildtyp och genetiskt modifierade djur är en väletablerad och klassisk strategi för att undersöka cell inneboende kontra cell yttre funktioner kandidatgener 1-6. Blastula transplantationer i zebrafisk har i stor utsträckning används för att generera chimära embryon för studier av cell autonomi 7-9. Beroende på vävnaden av intresse, kan det dock vara svårt att förutsägbart rikta givarceller till den önskade vävnaden (t ex blod) 1-3, 7-9. Mus genetiker har länge utnyttjat parabiotic kirurgiska metoder för att generera siamesiska organismer med en gemensam omsättning 10-14. Eftersom de parabiotic djuren delar en gemensam blodomloppet kan interaktioner mellan celler som har sitt ursprung från ett djur med celler från det andra djuret av en annan genetisk bakgrund studeras 10-16. Nyligen Karima Kissa grupp elegant visat förmåga till CREåt förenade zebrafisk embryon och sedan använda detta system för att studera hematopoietiska stam- och progenitorceller (HSPC) migration 15. Dessutom har zebrafisk parabiosis nyligen använts för att undersöka rollen av endotelceller cadherin 5 i hematopoetisk stamcellstransplantation (HSC) uppkomst och migration, 16 och studera betydelsen av stromaceller i HSPC nisch under zebrafisk utveckling 17.
Till skillnad från möss, zebrafisk embryon är transparenta och möjliggöra direkt visualisering av celler under parabiotic utveckling, vilket gör systemet unikt kraftfull. Nyttan av parabiosis i zebrafisk, men begränsas av en brant inlärningskurva, och parabiotic kirurgi på den känsliga embryon kan vara tekniskt utmanande utan detaljerade instruktioner och visuell demonstration. Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att följa videobaserade självstudier om hur man skapar parabiotic zebrafisk embryon för att studeratemporal, cell-intrinsic, eller cell extrinsic funktionerna hos en kandidat gen (er) genom kirurgisk fusion av att utveckla blastulae. Nyckel modifikationer och ytterligare rekommendationer för att öka parabiont överlevnad och nya experimentella applikationer ingår.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parabiotic fusion har varit ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellulära funktioner av kandidatgener hos vuxna musmodeller och kycklingembryon 10-14. På senare tid har ett blastula fusion metod beskrivits för att generera förenade zebrafisk embryon 15. I det nuvarande protokollet, är videobaserade självstudier för att demonstrera och bättre beskriva den metod för att skapa parabiotic zebrafisk embryon med olika genetisk bakgrund för att studera tids, cell inneboende, och cell yttr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
