Method Article

Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

DOI:

10.3791/54168

⸱

June 11th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Boston Children’s Hospital, 2Harvard Medical School, 3Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Stem Cell Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology, 6Howard Hughes Medical Institute, 7Division of Hematologic Malignancies, Dana-Farber Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole fournit des instructions étape par étape sur la façon de générer des embryons de poisson-zèbre parabiotique de différents antécédents génétiques. Lorsqu’elle est combinée aux capacités d’imagerie inégalées de l’embryon de poisson-zèbre, cette méthode fournit un moyen unique et puissant d’étudier les fonctions autonomes cellulaires par rapport aux fonctions non autonomes cellulaires pour les gènes candidats d’intérêt.

Abstract

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parabiose chirurgicale de deux animaux de différentes origines génétiques crée un scénario unique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des rôles de cellules extrinsèque pour les gènes candidats d'intérêt, les comportements migratoires des cellules, et des signaux sécrétées dans les milieux génétiques distincts. Parce que les animaux parabiose partagent une circulation commune, de sang ou d'un facteur par le sang d'un animal ne sera échangée avec son partenaire et vice-versa. Ainsi, les cellules et les facteurs moléculaires dérivées d'un fond génétique peuvent être étudiés dans le cadre d'un deuxième arrière-plan génétique. Parabiose des souris adultes a été largement utilisé pour le vieillissement de la recherche, le cancer, le diabète, l'obésité et le développement du cerveau. Plus récemment, parabiose des embryons de poisson zèbre a été utilisé pour étudier la biologie du développement de l'hématopoïèse. Contrairement aux souris, la nature transparente des embryons de poisson zèbre permet la visualisation directe des cellules dans le contexte parabiose, ce qui en fait une méthode unique et puissant pour étudier fmécanismes cellulaires et moléculaires FONDAMENTAUX. L'utilité de cette technique, cependant, est limitée par une courbe d'apprentissage abrupte pour générer les embryons de poisson zèbre parabiose. Ce protocole fournit une méthode étape par étape sur la façon de fusionner chirurgicalement l'blastulas de deux embryons de poisson zèbre de différentes origines génétiques pour étudier le rôle des gènes candidats d'intérêt. En outre, les embryons de poisson zèbre parabiose sont tolérants au choc thermique, ce qui rend le contrôle temporel de l'expression du gène possible. Cette méthode ne nécessite pas un système sophistiqué set-up et a de larges applications pour l' étude de la migration des cellules, la spécification du destin, et la différenciation in vivo au cours du développement embryonnaire.

Introduction

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Création de mosaïques génétiques (chimères) entre type sauvage et les animaux génétiquement modifiés est une stratégie bien établie et classique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des fonctions cellulaires extrinsèque de gènes candidats 1-6. Blastula transplantation chez le poisson zèbre a été largement utilisé pour générer des embryons chimères pour les études de cellules-autonomie 7-9. Selon le tissu d'intérêt, cependant, il peut être difficile de cibler de manière prévisible les cellules du donneur au tissu désiré (par exemple, le sang) 1-3, 7-9. Généticiens souris ont longtemps utilisé des méthodes chir....

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Protocol

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Ce protocole a été approuvé par le Comité soin et l'utilisation Animal Hospital de Boston Children. Ce protocole est modifié à partir d' une méthode précédemment publiée le 15.

1. Préparation des réactifs (jours ou semaines à l'avance)

  1. Préparer des plats d'agarose revêtues de 1,5%. Ajouter 1,5 g d'agarose à 100 ml de milieu Zebrafish E3 dans un flacon Erlenmeyer. Chaleur, dissoudre l'agarose, puis verser environ 5 ml en 100 mm de diamètre x 20 mm de boîtes de Pétri profondes.
    Note: Ils sont utilisés pour dechorionation d'embryons (étape 3.1) et pour la chirurgie parabiose....

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Results

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Conformément aux études publiées antérieurement 15, avec succès la fusion parabiose des embryons de poisson zèbre dépend de la mise en scène et l' orientation des deux embryons et la concentration de méthylcellulose. Avec seulement quelques outils simples et peu coûteux, blastulas développement chirurgicalement fusionnées ont été générés qui a grandi dans des embryons parabiose avec la circulation partagée. Ces outils comprennent une pipette modifiée Pasteur, une pompe à pipet.......

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Discussion

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Fusion parabiose a été un outil puissant pour étudier les fonctions cellulaires de gènes candidats dans des modèles murins adultes et d' embryons de poulet 10-14. Plus récemment, une méthode blastula de fusion a été décrite pour la génération d' embryons de poisson zèbre conjoints 15. Dans le présent protocole, des didacticiels vidéo sont utilisés pour démontrer et mieux décrire la méthodologie pour la création d'embryons de poisson zèbre parabiose de différentes origines génétiques afi.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

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Nous remercions Julie R. Perlin pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. D.I.S. est soutenu par des subventions de l’American Society of Hematology, de la Fondation de l’anémie de Cooley et des NIH (K01DK085217 et R03DK100672). E.J.H. est membre de l’Institut médical Howard Hughes de la Fondation Helen Hay Whitney. B.L. est titulaire d’une bourse de recherche médicale de l’Institut Howard Hughes. B.W.B. est soutenu par une bourse Irvington de l’Institut de recherche sur le cancer et un jeune chercheur Prix de la Fondation Conquer Cancer de l’ASCO. L.I.Z. est soutenu par des subventions des NIH (R01CA103846, P01HL032262 et R01HL04880), de la Fondation Taub pour l....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MéthylcelluloseSigmaM0387
Composants individuels pour E3/HCR :Pour 1L : 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4
NaCl (chlorure de sodium)Sigma-AldrichS9888
KCl (chlorure de potassium)Sigma-AldrichP9541
CaCl2 (Chlorure de calcium dihydraté)Sigma-Aldrich223506
MgSO4 (Sulfate de magnessium heptahydraté)Solution tampon Sigma-Aldrich230391
Hepes (1M )ThermoFisher15630-080
NomEntrepriseCatalog Nombre <
strong>Antibiotiques :
Pen/Strepgibco by Life technologies15140-120
Sel sodique d’ampicilineSigma Life ScienceA0166
Sulfate de kanamycine de Streptomyces kanamyceticusSigma Life ScienceK1377
Name CompanyNuméro de catalogue
50 mg/ml Pronase de Streptomycesgriseus Roche11459643001
verre capillaire utilisé pour les aiguilles (Capillary Glass & Filaments)Instrument SutterARTICLE# : BF 100-50-10
Aiguilles de taquinage avec poignées en boisFisher ScientificS07894
Pipettes Pasteur en verreFisherbrand13-678-20A
Pompe à pipette de 10 ml (vert) (Pipette Pump Pipettor)Novatech InternationalF37898-0000
Boîtes de Pétri en plastique de 100 mm de diamètre / 20 mm de profondeur (PARABOLE PETRI, 100/20 MM, PS, TRANSPARENT, AVEC ÉVENTS,
HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG )		Greiner Bio-one664102
Dextran, Bleu Cascade, 10 000 MW, Anionique, Lysine FixableThermoFisherD-1976
PTU. La charge de travail est de 0,003 % (50x est 0,15 %). pour 500 ml, 0,75 g N-PhénylthiouréeSigma-AldrichP7629
Tricaïne (poudre) (Tricaïne, Méthanesulfonato, Tricaïne-S)Western Chemical IncMS 222
Agarose LMP (Agarose LMP ultrapure)Invitrogen16520100
(juste l’extrémité large je pense)Fisherbrand137115AM
Plaques à 6 puits à fond de verre utilisées pour l’imagerieMatTekP06G1.5-20-F
pointe de chargement en plastique western gel fixée à l’extrémité d’une aiguille de dissection à manche en bois (pointes GELoader)Eppendorf22351656
couvercle en verre, lames et graisse sous vide si montage pour un microscope droit :
Graisse sous vide ( Dow Corning® ; graisse silicone sous vide poussé
incolore, poids 5,3 oz (tube) )		Dow CorningZ273554
Couverclesen verreCorning Sciences de la vie2960-244
Pipette de transfert en plastique

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  2. Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).

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Parabiotic Zebrafish EmbryosBlastula Surgical FusionZebrafish Embryo ParabiosisHematopoiesis Developmental BiologyCell Migration StudiesConfocal Microscopy ImagingHeat Shock Gene ExpressionTransgenic Zebrafish EmbryosMethylcellulose Embryo PositioningGlass Needle Suturing

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