מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים
Summary
הפרוטוקול המובא במחקר זה מתאר שיטות לניטור בזמן אמת של התקדמות מחדש באמצעות מדידת הקינטית של סמנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים באמצעות ניתוח תזרים cytometry. הפרוטוקול גם כולל את הערכה המבוססת על הדמיה של מורפולוגיה, סמן או ביטוי הכתב במהלך הדור iPSC.
Abstract
Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.
Introduction
החולה שמקורם בתאי גזע מושרים (iPSCs) הם כלים מבטיח טיפול בתא ההקרנה התרופה. הם מספקים מקור עצמי של תאים לטיפול. בנוסף, הם כוללים סט רחב מאוד של רקע גנטי, מה שמאפשר ניתוח במבחנה מפורט של מחלות גנטיות מעבר למה תאי גזע עובריים נוכחיים (ESC) קווים ייאפשרו. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מספר שיטות להפקת iPSCs, כולל תכנות מחדש בנגיף סנדאי, פלסמידים episomal או mRNAs 1,2. יש לציין, שיטות תכנות מחדש שונות קשורות עם רמות משתנות של יעילות ובטיחות, וכן צפויים שונים באופנים אחרים המשפיעים והתאמתו ליישומים שונים. עם הזמינות של מגוון רחב של טכנולוגיות תכנות מחדש, זה הפך להיות חשוב לפתח שיטות להערכת תהליך תכנות מחדש. רוב השיטות הקיימות להסתמך על בדיקה איכותית של מורפולוגיה או מכתיםעם צבעים ונוגדני תא ספציפי גזע. שיטה שפותחה לאחרונה אחת עושה שימוש לכתבי קרינת lentiviral רגישים miRNAs PSC ספציפי או mRNAs תא ספציפי בדיל 3. שיטות מעקב כזה להקל על הבחירה ואופטימיזציה של טכניקות תכנות מחדש למצבים שונים. לדוגמא, CDy1 שמש בדיקת ניאון עבור iPSCs מוקדם כדי למסך מאפנני תכנות מחדש 4. היכולת להתבונן ולהשוות ניסויים תכנות מחדש שונים הינה עניין מהותי, להבנה טובה יותר של התהליך עצמו. למשל, כיום ידוע כי סוגים מסוימים תא סומטי קלים יותר לתכנת מחדש מאחרים 5, וכי תאים לעבור מצבי ביניים במהלך תכנות מחדש 6-8. למרבה הצער, את המנגנונים העומדים בבסיס תהליך תכנות מחדש עדיין אינם מובנים לחלוטין וכתוצאה מכך, ההבדלים המדויקים בין שיטות תכנות מחדש להישאר גם כדי להיות Defined. לפיכך, שיטות לניטור, שמאות והשוואת אירועי תכנות מחדש להמשיך להיות קריטי עבור השדה התא גזע.
השיטות שתוארו בפרוטוקול זה לאפשר הניטור והערכה של תהליך תכנות מחדש ותדגמנה טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להשוות קבוצות שונות של ריאגנטים תכנות מחדש. נקודת המבט הראשון הוא cytometry זרימה מנתח באמצעות שילובים של נוגדנים נגד תאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים סמנים (PSC). הדמיה בזמן אמת זוגות הגישה השנייה ומדידת מפגש הכולל (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי תאים) ואת המפגש של אותות סמן (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי אותות ניאון).
Protocol
Representative Results
Discussion
This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים צ'אד מקארתור לדיונים מועילים.
Materials
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1X) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
- Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Quintanilla, R. H., Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
- Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
- Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
- Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
- Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
- Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
- Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
- Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).
