Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
Macrophages et les cellules dendritiques (CD) sont des cellules immunitaires innées présentes dans les tissus et les organes lymphoïdes qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes. Cependant, ils sont difficiles à isoler en nombre suffisant pour les étudier en détail, par conséquent, des modèles in vitro ont été développés. Dans les cultures in vitro de macrophages dérivés de la moelle osseuse et les cellules dendritiques sont des méthodes précieuses et bien établies pour les études immunologiques. Ici, un procédé de mise en culture et identifier à la fois les DC et les macrophages à partir d'une seule culture de cellules de moelle osseuse de souris en utilisant la première facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages de cytokines (GM-CSF) est décrit. Ce protocole est basé sur la procédure établie d' abord développé par Lutz et al. en 1999 pour les PED dérivées de la moelle osseuse. La culture est hétérogène, et MHCII et hyaluronane fluorescéine (FL-HA) sont utilisés pour distinguer les macrophages de CD immatures et matures. Ces GM-CSF dérivé macrophages proVidé une source pratique d'in vitro des macrophages dérivés qui ressemblent étroitement à des macrophages alvéolaires dans les deux phénotype et la fonction.
Introduction
Plusieurs méthodes de culture in vitro ont été décrits pour générer des macrophages d'os dérivées de la moelle (BMDMs) et les CD dérivées de la moelle osseuse (BMDC) en utilisant un ou une combinaison de facteurs de croissance. BMDMs peut être produite en cultivant des cellules de moelle osseuse en utilisant soit le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) ou le GM-CSF 1,2. Pour BMDCs, l'addition d' un ligand de FLT3 dans la culture de moelle osseuse donne lieu à des DC plasmacytoïdes classiques et non-adhérentes (CD11c haut / MHCII haut et CD11c lo, B220 + , respectivement) après 9 jours de culture , 3,4. En revanche, les cellules non adhérentes générées après 7 à 10 jours de culture avec GM-CSF seul 5,6, GM-CSF et l' IL-4 7, ou le GM-CSF et FLT3 ligand 8,9 génèrent BMDCs ressemblant davantage les PED inflammatoires (CD11c haute, MHCII haute CD11b +) 10. Bien que ces cultures in vitro sont utilisées pour générer des macrophages ouDC, il est difficile de savoir si chaque culture donne lieu à des populations pures. Par exemple, bien que les cellules adhérentes dans les cultures GM-CSF sont décrits comme les macrophages 5, les cellules non-adhérentes de la même culture sont utilisés comme DC 6,11-13, avec la présomption qu'ils sont homogènes et toute variabilité observée est en raison de différents stades de développement 14,15. En outre, des études ont montré GM-CSF d'être un facteur de croissance essentiel pour le développement des macrophages alvéolaires in vivo 16,17, et peuvent être utilisés in vitro pour générer alvéolaires comme les macrophages 16,17,18.
Autre que l'adhésion, les procédures de génération des macrophages et des pays en développement à partir de cultures de moelle osseuse GM-CSF traités sont très similaires suggérant l'hétérogénéité peuvent exister au sein des cultures de moelle osseuse GM-CSF. Cela semble bien être le cas que deux documents font état de la présence de BMDMs dans la fraction non adhérente des cultures BMDC. Dans un papier, ils identified une population de cellules que CD11c +, CD11b +, MHCII mi, MerTK + et CD115 +, qui exprimait une signature d'expression génique qui ressemblait plus étroitement les macrophages alvéolaires et avait une capacité réduite à activer les cellules T 19. Le second papier utilisé MHCII et FL-HA pour identifier une population de type macrophage alvéolaire (CD11c +, MHCII mid / low, FL-HA élevé) qui était distincte de immature (CD11c +, MHCII mi, FL-HA bas) et mature DC (CD11c +, MHCII haute), à la fois phénotypiquement et fonctionnellement 18. Ces documents illustrent les deux que les cultures GM-CSF BMDC sont hétérogènes, contenant à la fois des macrophages et des populations DC indiquant que les soins doivent être prises lors de l'interprétation des données à partir de cultures BMDC.
Ce protocole décrit comment isoler la moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse dans la culture de GM-CSF, et d'identifier les alvéoles macrophagepopulation à partir des CD immatures et matures dans la culture de la moelle osseuse par cytométrie en flux en utilisant la liaison et l'expression MHCII FL-HA. Cette procédure est basée sur la procédure établie de Lutz et al 6 et est capable de générer. 5 – 10 x 10 6 cellules non adhérentes au jour 7 de la culture de 10 ml. La culture est utilisable de jours 7 à 10 et on obtient une population hétérogène de macrophages, DCs immatures et matures, ainsi que des progéniteurs au jour 7. Ceci permet d' obtenir une méthode simple pour isoler et cultiver in vitro des macrophages alvéolaires analogues dans de grandes quantités.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, nous fournissons un procédé pour générer les macrophages et les DC GM-CSF provenant d'une culture de moelle osseuse de souris unique qui est adapté de Lutz et coll. 6. Expression MHCII et FL-HA distingue les CD immatures et les macrophages de liaison dans cette culture (voir la figure 3C), qui a été difficile. Ceci, combiné avec un autre rapport de Helft et al. 19, montre l' hétérogénéité au sein de GM-CSF cultures BMDC indu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (Grant MOP-119503) et les sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG) du Canada. Le CRSNG appuie également bourses d'été à YD et AA YD est pris en charge par l'Université de la Colombie-Britannique (UBC) avec une bourse de recherche de 4 ans, AA est pris en charge par les IRSC à l'attribution d'une maîtrise de l'étudiant diplômé (BESC-M). Nous remercions Calvin Roskelley d'assistance avec le microscope utilisé pour générer les images de la figure 2. Nous reconnaissons également le soutien des UBC animaux et de débit Installations cytométrie.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
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