Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
Los macrófagos y células dendríticas (DC) son células inmunes innatas que se encuentran en tejidos y órganos linfoides que juegan un papel clave en la defensa contra los patógenos. Sin embargo, son difíciles de aislar en número suficiente para estudiar en detalle, por lo tanto, los modelos in vitro se han desarrollado. Cultivos in vitro de macrófagos derivados de médula ósea y células dendríticas son valiosos métodos bien establecidos y para estudios inmunológicos. Aquí, se describe un método para el cultivo y la identificación de ambos DCs y macrófagos a partir de un único cultivo de células de médula ósea primaria de ratón utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos de citoquinas (GM-CSF). Este protocolo se basa en el procedimiento establecido primera desarrollada por Lutz et al. en 1999 para los países en desarrollo derivadas de médula ósea. El cultivo es heterogénea, y MHCII y hialuronano fluoresceinado (FL-HA) se utilizan para distinguir los macrófagos de CD inmaduras y maduras. Estos GM-CSF derivado macrófagos procionar una fuente conveniente de in vitro macrófagos derivados que se parecen mucho macrófagos alveolares tanto en fenotipo y la función.
Introduction
Varios métodos de cultivo in vitro se han descrito para generar macrófagos de médula derivadas de médula (BMDMs) y las DC derivadas de médula ósea (BMDCs) utilizando uno o una combinación de factores de crecimiento. BMDMs se puede generar mediante el cultivo de células de médula ósea usando factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Para BMDCs, la adición de ligando FLT3 para el cultivo de médula ósea da lugar a DCs plasmacitoides clásicos y no adherentes (CD11c alta MHCII alta y CD11c lo /, B220 +, respectivamente) después de 9 días en cultivo 3,4. En contraste, las células no adherentes generan después de 7 a 10 días en cultivo con GM-CSF solo 5,6, GM-CSF e IL-4 7, o GM-CSF y FLT3 ligando 8,9 generan BMDCs se parece más a los países en desarrollo inflamatorias (alta CD11c, CD11b + MHCII alta) 10. Si bien se utilizan estos cultivos in vitro para generar los macrófagos oLos países en desarrollo, no está claro si cada cultura da lugar a poblaciones puras. Por ejemplo, aunque se describen las células adherentes en los cultivos GM-CSF para ser macrófagos 5, las células no adherentes de la misma cultura se utilizan como los DC 6,11-13, con la presunción de que son homogéneos y cualquier variabilidad observada es debido a las diferentes etapas de desarrollo 14,15. Además, los estudios han encontrado GM-CSF para ser un factor de crecimiento esencial para el desarrollo de los macrófagos alveolares in vivo 16,17, y se pueden utilizar in vitro para generar los macrófagos alveolares como 16,17,18.
Aparte de la adhesión, los procedimientos para la generación de los macrófagos y los países en desarrollo de cultivos de médula ósea tratados con GM-CSF son muy similares sugiriendo heterogeneidad puede existir dentro de cultivos de médula ósea de GM-CSF. De hecho, esto parece ser el caso como dos documentos informan de la presencia de BMDMs en la fracción no adherente de las culturas BMDC. En uno de papel, que identified una población de células como CD11c +, CD11b +, MHCII mediados, MerTK + y CD115 +, que expresa una expresión genética que se parecía más estrechamente los macrófagos alveolares y tenía una capacidad reducida para activar las células T 19. El segundo papel utilizado MHCII y FL-HA para identificar una población de macrófagos alveolares similar (CD11c +, MHCII media / baja, FL-HA de alto) que era distinta de inmaduros (CD11c +, MHCII mediados, FL-HA baja) y madura DC (CD11c +, MHCII alta), tanto fenotípicamente y funcionalmente 18. Estos documentos ilustran que ambos cultivos GM-CSF BMDC son heterogéneos, que contiene tanto los macrófagos y DC poblaciones que indica que se debe tener cuidado al interpretar los datos a partir de cultivos de BMDC.
Este protocolo describe cómo aislar de la médula ósea, células de médula ósea en cultivo GM-CSF, e identificar el alveolar similar a macrófagospoblación de los países en desarrollo inmaduro y maduros en el cultivo de médula ósea mediante citometría de flujo utilizando la unión y la expresión MHCII FL-HA. Este procedimiento se basa en el procedimiento establecido de Lutz et al 6 y es capaz de generar. 5 – 10 x 10 6 células no adherentes en el día 7 de un cultivo de 10 ml. El cultivo se puede utilizar desde días 7 a 10 y se obtiene una población heterogénea de macrófagos, células dendríticas inmaduras y maduras, así como algunos progenitores en el día 7. Esto proporciona un método simple para crecer y aislar in vitro macrófagos alveolares-como en grandes cantidades.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se proporciona un método para la generación de los macrófagos y las CD GM-CSF derivados de una sola cultivo de médula ósea de ratón que está adaptado de Lutz et al. 6. MHCII expresión y FL-HA distingue entre países en desarrollo inmaduro y macrófagos vinculante en esta cultura (ver Figura 3C), que previamente ha sido difícil. Esto, junto con otro informe de Helft et al. 19, demuestra la heterogeneidad dentro de las culturas BMDC indu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (Grant RP-119503) y el Consejo de Ciencias e Ingeniería de la Naturaleza de Canadá (NSERC). CRSNG también apoyó becas de verano para YD YD y AA es apoyado por la Universidad de Columbia Británica (UBC), con un premio de beca de 4 años, AA es apoyado por CIHR con la concesión de un Maestro estudiante graduado (CGS-M). Agradecemos a Calvin Roskelley para obtener ayuda con el microscopio utilizado para generar las imágenes en la Figura 2. También reconocemos el apoyo de los animales y el flujo de Instalaciones de citometría de UBC.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
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