Generering och identifiering av GM-CSF Derived Alveolära liknande makrofager och dendritiska celler från benmärg från mus
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
Makrofager och dendritiska celler (DC) är medfödda immunceller som finns i vävnader och lymfoida organ som spelar en viktig roll i försvaret mot patogener. Men de är svåra att isolera i tillräckligt antal för att studera dem i detalj, därför har in vitro-modeller har utvecklats. In vitro kulturer av benmärgsmakrofager och dendritiska celler är väletablerade och värdefulla metoder för immunologiska studier. Här, är en metod för odling och identifiering av både DCS och makrofager från en enda kultur av primär mus benmärgsceller med användning av cytokinen granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) som beskrivits. Detta protokoll är baserat på det fastställda förfarandet först utvecklades av Lutz et al. 1999 för benmärgshärledda DC. Kulturen är heterogen, och MHCII och fluoresceinerad hyaluronan (FL-HA) används för att skilja makrofager från omogna och mogna DC: er. Dessa GM-CSF härledda makrofager provide en lämplig källa för in vitro härledda makrofager som nära liknar alveolära makrofager i både fenotyp och funktion.
Introduction
Flera in vitro-odlingsmetoder har beskrivits för att generera benmärgshärledda makrofager (BMDMs) och benmärgshärledda DCs (BMDCs) genom att använda en eller en kombination av tillväxtfaktorer. BMDMs kan genereras genom odling av benmärgsceller med användning av antingen makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) eller GM-CSF 1,2. För BMDCs tillsatsen av FLT3-liganden till benmärgen kultur ger upphov till icke-vidhäftande klassiska och plasmacytoid DC (CD11c hög / MHCII hög och CD11c lo, B220 + respektive) efter 9 dagar i kultur 3,4. I motsats, icke vidhäftande celler genereras efter 7 till 10 dagar i odling med GM-CSF enbart 5,6, GM-CSF och IL-4 7, eller GM-CSF och FLT3-liganden 8,9 generera BMDCs närmare liknar inflammatoriska DCs (CD11c hög, MHCII hög CD11b +) 10. Medan dessa in vitro-kulturer används för att generera makrofager ellerDCs är det oklart om varje kultur ger upphov till rena populationer. Till exempel, även vidhäftande celler i de GM-CSF-odlingar beskrivs att vara makrofager 5, de icke-vidhäftande celler från samma kultur används som DCs 6,11-13, med antagandet att de är homogena och eventuella observerade variabiliteten är på grund av olika utvecklingsstadier 14,15. Vidare har studier fann GM-CSF för att vara en viktig tillväxtfaktor för alveolär makrofag utveckling in vivo 16,17, och kan användas in vitro för att generera alveolära liknande makrofager 16,17,18.
Annat än följsamhet, förfarandena för generering av makrofager och DC från GM-CSF behandlade benmärgskulturer är mycket lika tyder heterogeniteten kan existera inom GM-CSF benmärgsodlingar. Detta verkar faktiskt vara fallet som två artiklar rapporterar förekomsten av BMDMs i den icke-vidhäftande fraktionen av BMDC kulturer. I ett papper, identifi deed en population av celler som CD11c +, CD11b +, MHCII mitten, MerTK +, och CD115 +, som uttryckte en genuttryck signatur som närmast liknade alveolära makrofager och hade en minskad förmåga att aktivera T-celler 19. Den andra papper som används MHCII och FL-HA för att identifiera en alveolär makrofag-liknande population (CD11c +, MHCII mitten / låg, FL-HA hög) som var skild från omogna (CD11c +, MHCII mitten, FL-HA låg) och mogna DCs (CD11c +, MHCII hög), både fenotypiskt och funktionellt 18. Dessa papper båda visar att GM-CSF BMDC kulturer är heterogena, som innehåller både makrofager och DC populationer tyder på att försiktighet bör iakttas vid tolkning av data från BMDC kulturer.
Detta protokoll beskriver hur man isolerar benmärg, odling benmärgsceller i GM-CSF, och identifiera den alveolära makrofag-liknandebefolkningen från de omogna och mogna DC i benmärgen kulturen genom flödescytometri med användning FL-HA-bindning och MHCII uttryck. Detta förfarande är baserat på det fastställda förfarandet av et al Lutz 6 och kan generera 5 -. 10 x 10 6 icke-vidhäftande celler på dag 7 av 10 ml kultur. Kulturen kan användas från dagar 7 till 10 och ger en heterogen population av makrofager, omogna och mogna DC: er, såväl som vissa progenitorer på dag 7. Detta ger en enkel metod för att växa och isolera in vitro alveolar-liknande makrofager i stora mängder.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript, tillhandahåller vi ett förfarande för att generera GM-CSF härledda makrofager och DC: er från en enda mus benmärgskultur som är anpassad från Lutz et al. 6. MHCII uttryck och FL-HA-bindande åtskillnad mellan omogna DC och makrofager i kultur (se figur 3C), som tidigare varit svårt. Detta tillsammans med en annan rapport från Helft et al. 19 visar heterogenitet inom GM-CSF inducerade BMDC kulturer som tidigare ansågs vara endast DC. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119.503) och naturvetenskap och teknik Council of Canada (NSERC). NSERC stödde också sommaranställning till YD och AA YD stöds av University of British Columbia (UBC) med en 4-årig gemenskap utmärkelse, är AA stöds av CIHR med en doktorand magisterexamen award (CGS-M). Vi tackar Calvin Roskelley för hjälp med mikroskop används för att generera bilderna i figur 2. Vi erkänner också stöd från UBC djur och flödescytometri lokaler.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
References
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
