Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Tijdens reconstructieve bot chirurgie, zijn suprafysiologische hoeveelheden groeifactoren empirisch geladen op steigers voor een succesvolle fusie bot te promoten. Grote doses van zeer krachtige biologische agentia dienen door groeifactor instabiliteit als gevolg van de snelle enzymatische afbraak en carrier inefficiënte lokaliseren voldoende hoeveelheden groeifactor bij implantatie sites. Derhalve strategieën die de stabiliteit van groeifactoren verlengen zoals BMP-2 / NELL-1 en controle het vrijkomen kon eigenlijk hun lagere effectieve dosis en derhalve voor hogere doseringen minder nodig tijdens toekomstige botregeneratie operaties. Dit zal bijwerkingen en groeifactor verlagen. Zelf geassembleerde PEC's zijn vervaardigd om een betere controle van de BMP-2 / NELL-1 levering bieden via heparine bindend en verdere potentiëren groeifactor bioactiviteit door het versterken van in vivo stabiliteit. Hier illustreren we de eenvoud van PEC fabricage die helpt bij het delivery van diverse groeifactoren in bot reconstructieve chirurgie.
De incidentie van pseudoartrose gerapporteerd wel 10 tot 45% degeneratieve spinale fusie en herziening spinale chirurgie 1 te zijn. De snelheid van pseudarthrose tijdens wervelkolomfusie en andere reconstructieve operaties bot, osteogene groeifactoren zoals BMP-2, Nell-1 1 en bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) zijn ingevoerd om de novo osteogenese goede kan komen. Hiervan BMP-2 is een populaire keuze voor spinale fusie-2. Hoewel de potentie van BMP-2 bij het induceren en nieuwe botvorming vergemakkelijken is goed ingeburgerd 3; klinisch significante complicaties zoals heterotope botvorming, seroom en hematoomvorming, ontstekingsreactie, radiculitis, wervellichaam osteolyse en retrograde ejaculatie blijven punten van zorg vanwege de suprafysiologische gebruikshoeveelheid 4,5.
Daarom verlagen van de dosis van BMP-2 blijft een relevante strategie in tenverleidt om bijwerkingen te minimaliseren. Daarnaast worden efficiënte carrier-systemen die nodig is om de eerste burst release van BMP-2 waargenomen in de hedendaagse collageenspons draagsystemen te onderdrukken en de verdere langdurige en gelokaliseerde aflevering van deze potente cytokine verbeteren. De laag voor laag zelfassemblage van afwisselend kationische en anionische polyelektrolyten kunnen worden gebruikt als een afstembare methode opbouwen polyelektrolyt complexen op het oppervlak van scaffold matrices of implanteerbare materialen 6. In dit verband heeft heparine (bekend om de hoogste negatieve ladingsdichtheid van biologische agentia) zijn erkend gretig binden met verschillende groeifactoren via elektrostatische en heparine bindende domeinen. Inderdaad, heparine aangetoond dat de halfwaardetijd te verlengen en aldus potentiëren de bioactiviteit van verschillende groeifactoren.
Op basis hiervan onze groep aangepast een laag voor laag zelfassemblage protocol bij een heparine gebaseerde polyelektrolytcomplex (PEC) die fabriceren ladingen en behoudt de biologische activiteiten van osteogene groeifactoren tijdens immobilisatie 7,8. Het alginaat microbead kern werd vervaardigd door het verknopen α-L-guluronate (G) residuen van alginaat met tweewaardig kation calcium of strontium ionen. Het alginaat kern is een biologisch afbreekbare matrix scaffold; die na de implantatie, is het geresorbeerd in de fusie bed ruimte bieden voor bony ingroei. Poly-L-lysine (PLL) of protamine wordt gebruikt als de kationische laag naar interlace met zowel de steiger matrix (in dit geval het alginaat microkorrel dragerdeeljes) en de negatief geladen heparine; terwijl de anionische heparine laagfuncties te stabiliseren en te lokaliseren geladen groeifactoren. De drielaags PEC is aangetoond groeifactor laadvermogen in een varkensmodel 9 verhogen. Recent zijn PEC dragers is aangetoond dat de effectieve dosis van BMP-2 succesvol met tenminste 20-voudig 10 ratten, varkens modellen van spinale fusie-8.
ntent "> Hier melden wij de methoden voor het vervaardigen van PEC voor een betere groeifactor levering in spinale fusie en de andere reconstructieve chirurgie bot met behulp van BMP-2 als een model osteogene groeifactor.Dit protocol geeft een werkwijze voor de bereiding van PEC door laag voor laag zelfassemblage. De laag-voor-laag structuur gevisualiseerd met behulp van fluorescente analogen van protamine, heparine, BMP-2 en NELL-1 en confocale microscopie. Opname en release tests tonen aan dat heparine op PEC medieert osteogene groeifactor opname en afgifte. De opname efficiëntie van de PEC methode is: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. De PEC drager een betere modulatie Nell-1 (20%) afgifte met een zuiver oppervlakteadsorpti…
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
24 well plate | Cell Star | 662160 | |
96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
DMEM | Gibco | 12320 | |
BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
Incubator | Binder | C8150 | |
MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
Shaker | Labnet | S2025 | |
Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
Spatula | 3dia | ||
5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |