Complexe de polyélectrolyte pour Heparin Binding Domain Growth Factor ostéogénique Livraison
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
Pendant les chirurgies reconstructives osseuses, des quantités supraphysiologiques de facteurs de croissance sont empiriquement chargés sur des échafaudages pour promouvoir avec succès la fusion osseuse. De fortes doses d'agents biologiques très puissants sont nécessaires en raison de l'instabilité facteur de croissance par suite de la dégradation enzymatique rapide, ainsi que l'inefficacité de support en localisant des quantités suffisantes de facteur de croissance sur les sites d'implantation. Par conséquent, les stratégies qui prolongent la stabilité des facteurs de croissance tels que le BMP-2 / NELL-1, et de contrôler leur libération pourrait effectivement réduire leur dose efficace et de réduire ainsi le besoin de doses plus importantes lors de futures opérations de la régénération osseuse. Cela permettra de réduire les effets secondaires et les coûts des facteurs de croissance. PECs auto-assemblées ont été fabriqués pour fournir un meilleur contrôle de la BMP-2 / NELL-1 livraison par liaison à l' héparine et autre facteur bioactivité de croissance de potentialisent en améliorant la stabilité in vivo. Ici, nous illustrons la simplicité de fabrication PEC qui facilite la delivery d'une variété de facteurs de croissance des os lors d'interventions chirurgicales de reconstruction.
Introduction
L'incidence de la pseudarthrose a été rapporté comme étant aussi élevé que 10 à 45% en fusion spinale dégénérative et de révision des chirurgies de la colonne vertébrale 1. Pour réduire le taux de pseudarthrose lors de la colonne vertébrale fusion et d' autres chirurgies reconstructives osseuses, des facteurs de croissance ostéogéniques tels que BMP-2, Nell-1 1 et facteur de croissance plaquettaire (PDGF) ont été introduites pour promouvoir de novo ostéogenèse. Parmi ceux – ci, la BMP-2 est un choix populaire pour la fusion vertébrale 2. Bien que l'activité de BMP-2 pour induire et faciliter la formation d'os a été bien établi 3; complications cliniquement significatives telles que la formation osseuse hétérotopique, sérome et formation d' un hématome, la réponse inflammatoire, radiculite, vertébral ostéolyse du corps, et l' éjaculation rétrograde continuent d'être sujets de préoccupation en raison des quantités utilisées supraphysiologiques 4,5.
Par conséquent, en abaissant la dose de BMP-2 reste une stratégie pertinente àtente de réduire au minimum les effets secondaires. Par ailleurs, les systèmes de support efficaces sont nécessaires pour supprimer la libération de rafale initiale de la BMP-2 observée dans des systèmes de support de l'éponge de collagène contemporaine et en outre améliorer l'administration prolongée et localisée de cette cytokine puissante. L'auto-assemblage couche par couche d' une alternance de polyélectrolytes cationiques et anioniques peuvent être utilisés en tant que méthode accordable pour construire des complexes de polyélectrolytes sur la surface des matrices d'échafaudage ou de matériaux implantables 6. A cet égard, l'héparine (connu pour avoir la plus forte densité de charge négative de tous les agents biologiques) a été reconnue pour lier avidement avec une variété de facteurs de croissance par l'intermédiaire des domaines de liaison électrostatique et l'héparine. En effet, l'héparine a été démontré que pour prolonger la demi-vie et donc de potentialiser l'activité biologique de plusieurs facteurs de croissance.
Sur cette base, notre groupe a adapté un protocole couche par couche auto-assemblage pour fabriquer un complexe polyélectrolyte à base d'héparine (PEC) qui les charges et conserve les activités biologiques de facteurs de croissance ostéogéniques lors de l' immobilisation 7,8. Le noyau de microbilles d'alginate a été fabriqué par réticulation d'α-L-guluronate (G) des résidus d'alginate avec des ions calcium en cations divalents ou de strontium. Le noyau d'alginate est une matrice d'échafaudage biodégradable; qui, après l'implantation, il est résorbé dans le lit de fusion fournissant la place pour l'interposition osseuse. Poly-L-lysine (PLL) ou la protamine est utilisée comme couche cationique entrelacer à la fois avec la matrice d'échafaudage (dans ce cas, le noyau alginate de support de microbilles) et l'héparine chargée négativement; tandis que les fonctions anioniques de la couche d'héparine pour stabiliser et localiser les facteurs de croissance chargés. La triple couche PEC a été montré pour augmenter la capacité de chargement du facteur de croissance dans un modèle porcin 9. Récemment, les transporteurs PEC ont été montré pour réduire avec succès la dose efficace de BMP-2 d'au moins 20 fois chez le rat 10 et modèles porcins de fusion rachidienne 8.
ntent "> Ici, nous rapportons les méthodes de fabrication d'PECs pour une meilleure prestation de facteur de croissance dans la fusion spinale et les autres chirurgies reconstructives osseuses en utilisant BMP-2 en tant que facteur modèle de croissance ostéogénique.Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente un procédé pour la préparation de CBV à travers la couche par couche auto-assemblage. La structure couche par couche est visualisée en utilisant des analogues fluorescents de protamine, l'héparine, la BMP-2 et NELL-1 et microscopie confocale. Captage et libérer les tests montrent que l'héparine sur le PEC médie l'absorption du facteur de croissance ostéogénique et la libération. L'efficacité de l'absorption de la méthode PEC est: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
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