Qui descriviamo i metodi per la dissezione dei tessuti fetali e materni da placenta umana termine, seguito da isolamento e l'espansione delle cellule stromali / staminali mesenchimali (MSC) da questi tessuti.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Mesenchimali staminali / cellule stromali (MSC) stanno emergendo come un candidato promettente per l'utilizzo nelle terapie a base di cellule 1. La maggior parte delle applicazioni sembrano indirizzare MSC-mediata riparazione dei tessuti o regolazione immunitaria 2. In molte di queste applicazioni, allogenico MSC può essere efficace come MSC autologhe 3. L'uso di MSC allogeniche ha il vantaggio economico di essere compatibile con la produzione su larga scala di dosi multiple di cellule da un unico tessuto sorgente 4 per trattare molti pazienti.
Storicamente, gli studi pre-clinici e clinici hanno utilizzato MSC-derivate dal midollo osseo 4. Il midollo osseo viene generalmente raccolti dalla cresta iliaca di un donatore volontario. Questo processo è invasivo, e solo una piccola quantità di midollo (~ 20 ml) viene raccolto attraverso un'unica foratura. Generare numeri clinicamente significativi di MSC richiede una espansione in vitro. Cellulare la potenza diminuisce con il numero di passaggio <sup> 3, creando un paradosso dove il numero teorico di cellule necessario per efficacia clinica è aumentato più la popolazione cellulare è espanso. In contrasto aspirati di midollo osseo, placenta termine è fisicamente grande tessuto di partenza (tipicamente 500-750 g 4), che può essere raccolto asetticamente corso di taglio cesareo senza rischi per il donatore. MSC derivato dalla placenta presentano durature proliferazione 5 e immunomodulante capacità di 6, superiore alle ossa MSC derivate dal midollo. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che un singolo placenta termine conteneva MSC sufficienti per la produzione di fino a 7.000 dosi cliniche 4. Queste caratteristiche rendono placenta un tessuto fonte ideale per la produzione di MSC allogeniche.
La placenta è un organo feto-materna, che consiste di tessuto fetale e materno 7, e quindi MSC di origine fetale o materno può essere, teoricamente, isolato. I seguenti riferimenti forniscono deinformazioni tailed sullo sviluppo e la patologia, nonché esame microscopico e macroscopico della placenta umana e degli annessi 8,9. La placenta corretta è composto in gran parte dei vasi sanguigni fetali e secretoria e cellule di sostegno chiamate trofoblasto, che costituiscono i villi coriali coperti dal frondosum chorion (piatto) 8. I villi placentari ramificati sono bagnate nel sangue materno consegnati dalle arterie uterine a spirale, che consente di nutrienti, ormoni e lo scambio di gas tra il feto e la madre. La placenta è ancorato al endometrio tramite cellule stromali deciduali materne e fetali trophoblasts extravillious si alternano nella matrice extracellulare 8. I villi convergono sulla piastra corionica fetale dove formano il cordone ombelicale 8.
Un risultato del primo workshop internazionale sulle cellule staminali placentari-Derived (2008) è stato un apprezzamento della necessità di standardizzare l'isolamento e characterization di cellule dalla placenta umana termine 10. A causa dell'anatomia della placenta, dissezione dei diversi tessuti, l'isolamento di MSC e dei risultati attesi cultura può essere schiacciante per i nuovi arrivati al campo. In questo protocollo, la raccolta dei tessuti placentari coriali, seguito da isolamento MSC e l'espansione è accuratamente dettagliata. MSC caratterizzazione mediante citometria di flusso e nella differenziazione in vitro sono considerati di routine 5,11-13, e quindi solo brevemente descritti.
Come evidenziato in una recente revisione sistematica della letteratura 14, MSC ottenuto dai villi coriali placentari sono generalmente assunti come fetale. Sebbene, solo il 18% degli studi ha esaminato l'origine del MSC ottenuto, e di questi, solo la metà degli studi riportati MSC fetale e l'altra metà riferito popolazioni MSC materni o misti. Ciascuna delle tre componenti del tessuto descritti (villi coriali, piastra e decidua coriali basale) sono bozzettoosed soprattutto del feto membrana / villi, e una piccola percentuale di cellule materne uterine di derivazione, che rimangono attaccati alla placenta consegnato. Forniamo dati che dimostrino che isolare MSC dal lato materno della placenta, piuttosto che la parte fetale della placenta, come abbiamo riportato in precedenza 5,11, è un materiale di partenza più appropriato se MSC materna sono desiderati. Questo protocollo descrive anche l'uso di XY FISH per validare contributo fetale o materno per colture cellulari. Mentre questo è un protocollo standard del produttore, questa analisi è spesso trascurato e la sua importanza sottovalutata 14.
La placenta è fisicamente grande organo feto-materna, da cui MSC fetale o materno può essere isolata 22. Qui, abbiamo fornito una panoramica dettagliata di anatomia placentare e istruzioni su come sezionare specificamente decidua (materna), villi coriali (fetale), e il tessuto piatto corionica (fetale) (Passo 2.2-2.4). Successivamente, abbiamo delineato un protocollo robusto che permette l'isolamento MSC da ciascuno di questi tre tessuti (passo 2.5-2.6). Espansione placentare MSC è efficiente e culture apparire simile a midollo osseo culture MSC (Figure 3 e 4). Differenziamento osteogenico è affidabile (Figura 5B), mentre la differenziazione adipogenico è generalmente meno efficiente (Figura 5C) 5.
Molti nuovi arrivati al campo saranno presumere che le culture derivate da fetale villi coriali o tessuti piastra coriali saranno arricchiti per fetale MSC. Tuttavia, nelle nostre mani fearricchimento delle cellule tal è solo transitoria quando media espansione MSC standard come DMEM-LG + 10% FBS è utilizzato 5. Qui forniamo risultati rappresentativi utilizzando tessuti placentari derivati da un bambino di sesso maschile. Utilizzando tessuti di placenta da un bambino di sesso maschile, le cellule fetali sono facilmente identificabili come avere i cromosomi XY, mentre le cellule materne sono identificabili come avere i cromosomi XX. La figura 6 mostra XY risultati FISH per una cultura rappresentante. Mentre MSC fetale (XY) sono arricchiti (fino all'80%) nelle colture iniziali derivate da fetale villi corionica o tessuti piastra coriali, queste stesse culture sono rapidamente superate (~ 100%) materna (XX) MSC nei primi due passaggi . In mezzo standard, composto da DMEM-LG + 10% FBS, i pochi MSC materno-derivati che contaminano i tessuti fetali outcompete le cellule fetali di derivazione nella cultura.
Un passo fondamentale delineato in questo protocollo è un apprezzamento dell'anatomia placentare e da dove fetalee dei tessuti materni può essere più efficace raccolta. Come indicato nella sezione rappresentante risultati, la dissezione di tessuto fetale non consentire l'arricchimento transitoria per MSC feto-derivati. Miglioramenti in espansione medio formulazione, attraverso specifiche medie supplementazione fattore di crescita esogena dovrebbero consentire l'espansione selettiva delle popolazioni MSC fetali-derivati, e la produzione di un prodotto cellulare che si arricchisce per fetale piuttosto che cellule materne (il nostro gruppo sta attualmente sviluppando tali formulazioni di media). La fabbricazione delle popolazioni MSC fetali può avere un numero di vantaggi, come MSC fetale sono preteso per avere una maggiore angiogenesi e proprietà immunosoppressive che equivalente popolazioni MSC materni 37.
In ciascuno dei protocolli di isolamento descritti, abbiamo usato circa 10 g di tessuto. Un intero placenta è tipicamente 500-750 g, e nel lavoro precedente abbiamo dimostrato che attraverso il tessuto automatizzato digest e un bioreattore proc espansione delle celluleesses che dovrebbe essere possibile produrre oltre 7.000 dosi di cellule clinici da una sola placenta 4. Questi numeri evidenziano la potenziale idoneità di MSC placentare-derivati nelle terapie MSC allogeniche, e il significato di questo metodo indipendentemente dall'origine MSC (fetale o materno). Dal punto di vista terapeutico, è più critico che gli utenti hanno una comprensione completa del prodotto cellulare e la capacità di produrre in modo affidabile questo prodotto cellulare. Ci auguriamo che il nostro video vi aiuterà i ricercatori a capire l'anatomia della placenta, isolare MSC dalla placenta, e anticipare la probabile composizione delle cellule fetali o materna delle loro culture.
The authors have nothing to disclose.
RP è stata sostenuta da un Salute e Medical Research Council (National NHMRC) Postdoctoral Fellowship Training. VS è stato sostenuto da una Università del Queensland Internazionale Postgraduate Student borsa di studio. MRD è stato sostenuto dalla NHMRC e Inner Wheel Australia.
Ringraziamo personale medico e infermieristico per l'assistenza nella consenso del paziente e la raccolta del campione. Ringraziamo il Prof. Nickolas Fisk, il Prof. Kerry Atkinson e il Dr Rohan Lourie per le discussioni penetranti in ostetricia, sviluppo feto-placentare e di anatomia placenta.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |