En este documento se describen los métodos para la disección de tejidos fetales y maternas de placenta humana a término, seguido por el aislamiento y expansión de células madre mesenquimatosas / estroma (MSC) de estos tejidos.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Mesenquimales del estroma células madre / (MSC) están emergiendo como un candidato prometedor para su uso en terapias basadas en células 1. La mayoría de las aplicaciones parecen apuntar a la reparación de tejidos MSC o mediada por la regulación inmune 2. En muchas de estas aplicaciones, alogénico MSC puede ser tan eficaz como MSC autólogas 3. El uso de MSC alogénicas tiene la ventaja económica de ser compatible con la fabricación a gran escala de múltiples dosis de células a partir de un solo tejido fuente 4 para el tratamiento de muchos pacientes.
Históricamente, los estudios preclínicos y clínicos han utilizado MSC-deriva de la médula ósea 4. La médula ósea se recoge generalmente de la cresta ilíaca de un donante voluntario. Este proceso es invasivo, y sólo una pequeña cantidad de médula ósea (~ 20 ml) se recoge en un solo pinchazo. La generación de números clínicamente significativas de MSC requiere una amplia expansión in vitro. potencia de la célula disminuye con el número de pases <sup> 3, creando una paradoja que se aumenta más la población celular se expande el número teórico de células requeridas para la eficacia clínica. En contraste con aspirados de médula ósea, placenta a término es un físicamente grande de tejido de partida (por lo general 500 a 750 g 4), que se puede recoger de forma aséptica durante la cesárea, sin riesgo para el donante. MSC derivados de la placenta tienen la proliferación y 5 inmunomodulador capacidad a largo plazo 6, superior a la del hueso MSC derivadas de médula. En un estudio anterior, hemos demostrado que una sola placenta a término contenía suficientes MSC para la fabricación de hasta 7.000 dosis clínicas 4. Estas características hacen de placenta un tejido fuente ideal para la fabricación de MSC alogénicas.
La placenta es un órgano maternofetal que consiste en tanto el tejido fetal y materna 7, y por lo tanto el MSC de origen fetal o materna puede ser, en teoría, aislado. Las siguientes referencias proporcionan deinformación de cola en el desarrollo y la patología, así como el examen microscópico y macroscópico de la placenta humana y sus anexos 8,9. La placenta adecuada se compone en gran parte de los vasos sanguíneos fetales y secretora y células de soporte llamadas trofoblastos, que constituyen las vellosidades coriónicas cubiertos por el corion frondoso (placa) 8. Las vellosidades placentarias ramificados se bañan en sangre materna liberado de las arterias espirales uterinas, lo que permite nutrientes, hormonas y el intercambio de gases entre el feto y la madre. La placenta se ancla al endometrio a través de las células del estroma de la decidua materna y trofoblastos fetales extravillious se intercalan en la matriz extracelular 8. Las vellosidades convergen sobre la placa coriónica fetal donde forman el cordón umbilical 8.
Uno de los resultados del primer Taller Internacional sobre Células Madre provenientes de la placenta (2008) fue una apreciación de la necesidad de estandarizar el aislamiento y characterization de las células de la placenta humana a término 10. Debido a la anatomía de la placenta, la disección de los diferentes tejidos, el aislamiento de MSC y los resultados esperados de cultivo puede ser abrumador para los recién llegados al campo. En este protocolo, la cosecha de tejidos coriónicas de la placenta, seguido por el aislamiento y la expansión de MSC es bien detallada. Caracterización MSC a través de citometría de flujo y diferenciación in vitro se considera tratamiento rutinario 5,11-13, y por lo tanto se detalla brevemente aquí.
Como se destacó en una reciente revisión sistemática de la literatura 14, MSC obtiene a partir de las vellosidades coriónicas de la placenta generalmente se supone que son fetal. A pesar de que sólo el 18% de los estudios examinó el origen del MSC obtenido, y de ellos, sólo la mitad de los estudios informó MSC fetal y la otra mitad informó poblaciones MSC maternos o mixtos. Cada uno de los tres componentes del tejido descritos en este documento (vellosidades coriónicas, coriónicas placa y decidua basal) son lososed principalmente de la membrana fetal / vellosidades, y una pequeña proporción de células maternas uterinos derivados, los cuales permanecen unidas a la placenta entregado. Proporcionamos datos que demuestran que el aislamiento de MSC desde el lado materno de la placenta, en lugar del lado fetal de la placenta, como hemos informado anteriormente de 5,11, es un material de partida más apropiado si se desean MSC materna. Este protocolo también describe el uso de XY FISH para validar contribución fetal o maternal a cultivos de células. Si bien este es un protocolo estándar del fabricante, este análisis es a menudo descuidado y su importancia subestimada 14.
La placenta es un órgano grande físicamente maternofetal, a partir del cual el MSC fetal o materna puede aislarse 22. En este documento, hemos proporcionado una descripción detallada de la anatomía de la placenta y la instrucción sobre la forma de diseccionar específicamente decidua (materna), vellosidades coriónicas (fetal), y la placa coriónica (fetal) tejido (Paso 2,2-2,4). Posteriormente, hemos descrito un protocolo robusto que permite el aislamiento de MSC de cada uno de estos tres tejidos (paso 2,5-2,6). Expansión de la placenta MSC es eficiente y culturas parece similar al hueso cultivos de MSC derivadas de médula (Figuras 3 y 4). La diferenciación osteogénica es fiable (Figura 5B), mientras que la diferenciación adipogénica es generalmente menos eficiente (Figura 5C) 5.
Muchos recién llegados al campo van a suponer que los cultivos derivados de vellosidades coriónicas o tejidos fetales placa coriónica se enriquecen de MSC fetal. Sin embargo, en nuestras manos FeTal enriquecimiento celular sólo es transitorio cuando el medio de expansión MSC estándar tal como DMEM-LG + 10% de FBS se utiliza 5. A continuación se muestran resultados representativos utilizando tejidos de la placenta derivados de un bebé de sexo masculino. Mediante el uso de tejido de la placenta de un bebé de sexo masculino, las células fetales son fácilmente identificables por tener cromosomas XY, mientras que las células maternas son identificables por tener cromosomas XX. La figura 6 muestra XY resultados de FISH para una cultura representativa. Mientras que el MSC fetal (XY) se enriquecen (hasta 80%) en los cultivos iniciales derivados de vellosidades coriónicas fetal o tejidos placa coriónica, estos mismos cultivos son superadas rápidamente (~ 100%) por la madre (XX) MSC durante los dos primeros pasajes . En medio estándar, compuesto de DMEM-LG + 10% de FBS, los pocos MSC-materna derivada que contaminan los tejidos fetales outcompete las células fetales obtenidas por cultivo.
Un paso crítico descrito en este protocolo es una apreciación de la anatomía de la placenta y de donde fetaly tejido materno se puede cosechar más eficaz. Como se indica en la sección de resultados representativa, la disección de tejido fetal no permiten el enriquecimiento transitorio de MSC fetal derivado. Las mejoras en la formulación del medio de expansión, a través de la suplementación medio del factor de crecimiento exógena específica deben permitir la expansión selectiva de las poblaciones de MSC-fetales derivados, y la producción de un producto de células que se enriquece por fetal en lugar de células maternas (nuestro grupo está desarrollando actualmente dichas formulaciones de medio). La fabricación de las poblaciones de MSC fetales puede tener una serie de ventajas, como MSC fetal se supone que tienen una mayor angiogénesis y propiedades inmunosupresoras que las poblaciones de MSC maternas equivalentes 37.
En cada uno de los protocolos de aislamiento descritas, se utilizó aproximadamente 10 g de tejido. Toda una placenta es típicamente 500-750 g, y en trabajos anteriores hemos demostrado que a través del tejido automatizado compendio y un proc biorreactor expansión celulareses que debería ser posible fabricar más de 7.000 dosis de células clínicos desde una única placenta 4. Estas cifras ponen de manifiesto la posible idoneidad de MSC placentaria derivada en terapias de MSC alogénicas, y la importancia de este método, independientemente del origen del MSC (fetal o materna). Desde una perspectiva terapéutica, es más crítico que los usuarios tienen una comprensión completa del producto celular y la capacidad de fabricar de forma fiable este producto celular. Esperamos que nuestro video ayudará a los investigadores a entender la anatomía placenta, aislar MSC de la placenta, y anticipar la composición celular fetal o materna probable de sus culturas.
The authors have nothing to disclose.
RP fue apoyado por el Consejo Nacional de la Salud y la Investigación Médica (NHMRC) Postdoctoral becas de formación. VS fue apoyado por una beca de la Universidad de Queensland Estudiante Internacional de Postgrado. MRD fue apoyada por el NHMRC e Inner Wheel Australia.
Damos las gracias al personal clínico y de enfermería para ayudar en el consentimiento del paciente y la toma de muestras. Agradecemos al Prof. Nickolas Fisk, el Prof. Dr. Kerry Atkinson y Rohan Lourie para discusiones interesantes en obstetricia, el desarrollo de la placenta y feto-placenta anatomía.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |