Häri beskriver vi metoder för dissektion av foster och moderns vävnader från mänskliga placenta, följt av isolering och expansion av mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) från dessa vävnader.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) är på väg att bli en lovande kandidat för användning i cellbaserade terapier 1. De flesta program verkar rikta MSC-medierad vävnadsläkning eller immunreglering 2. I många av dessa tillämpningar kan allogen MSC vara lika effektivt som autolog MSC 3. Användningen av allogena MSC har den ekonomiska fördelen av att vara kompatibel med den storskaliga tillverkningen av flera celldoser från en enda källa vävnad 4 att behandla många patienter.
Historiskt sett har prekliniska och kliniska studier utnyttjade MSC-härledda från benmärgen 4. Benmärg är i allmänhet samlas från höftbenskammen hos en frivillig donator. Denna process är invasiva, och endast en liten volym av märg (~ 20 ml) uppsamlas genom en enda punktion. Generera kliniskt betydelsefulla antal MSC kräver omfattande i expansions vitro. Totipotent minskar med passagenummer <sup> 3, vilket skapar en paradox, där det teoretiska antalet celler som krävs för klinisk effekt ökas desto mer cellpopulationen är expanderad. I motsats till benmärgsaspirat, är termen placenta en fysiskt stor startvävnad (typiskt 500-750 g 4), som kan skördas aseptiskt under kejsarsnitt utan risk för givaren. MSC härrör från moderkakan har långsiktig spridning 5 och immunmodulerande kapacitet 6, överlägsen härledd från benmärg MSC. I en tidigare studie visade vi att en enda term placenta innehöll tillräcklig MSC för tillverkning av upp till 7.000 kliniska doser 4. Dessa egenskaper gör placenta en idealisk källa vävnad för framställning av allogena MSC.
Moderkakan är en fetomaternal organ bestående av både foster och moderns vävnad 7, och därmed MSC foster eller moderdjuret kan vara teoretiskt, isolerad. Följande referenser ger detailed information om utvecklingen och patologi, samt mikroskopisk och makroskopisk undersökning av human placenta och närliggande organ 8,9. Moderkakan korrekt består till stor del av foster blodkärl och sekretoriska och stödja celler som kallas trofoblaster, som utgör de korionvilli omfattas av chorion frondosum (platta) 8. De grenade placenta villi badar i moderns blod levereras från livmoderspiral artärerna, som gör det möjligt näringsämne, hormon och gasutbyte mellan foster och moder. Moderkakan är förankrad i livmoderslemhinnan via moderns decidual stromaceller och foster extravillious trofoblaster varvas i extracellulärmatrix 8. Villi konvergera på fostrets chorionic plattan där de bildar navelsträngen 8.
Ett resultat av den första internationella workshop om Placental-Derived stamceller (2008) var en uppskattning av behovet av att standardisera isolering och characterization av celler från mänskligt placenta 10. På grund av anatomin av moderkakan, dissektion av olika vävnader, kan isolering av MSC och förväntade odlingsresultat vara överväldigande för nykomlingar på fältet. I detta protokoll, är skörden av placenta chorionic vävnader, följt av MSC isolering och expansion noggrant detaljerad. MSC karakterisering via flödescytometri och in vitro differentiering anses rutin 5,11-13, och därför endast kortfattat beskrivs här.
Som framhålls i en färsk systematisk litteraturöversikt 14 erhöll MSC från moderkakan korionvilli allmänhet antas vara foster. Även undersökte endast 18% av studierna ursprung MSC erhållna och av dem, bara hälften av studierna rapporterade foster MSC och den andra hälften rapporterade moderns eller blandade MSC populationer. Var och en av de tre vävnadskomponenter som beskrivs häri (chorionic villi, chorionic plattan och decidua basalis) är compSTÄNGD främst av den fetala membran / villi, och en liten andel av livmoderhärledda maternella celler, som sitter kvar på förlösta moderkakan. Vi tillhandahåller data som visar att isolera MSC från moderns sida av moderkakan, snarare än fostrets sidan av moderkakan, som vi tidigare har rapporterat 5,11, är en mer lämplig utgångsmaterial om modern MSC önskas. Detta protokoll beskriver också användningen av XY FISH att validera fetal eller maternell bidrag till cellkulturer. Även om detta är ett standardprotokoll från tillverkaren, är denna analys ofta försummas och dess betydelse underskattas 14.
Moderkakan är en fysiskt stor fetomaternal organ, som foster eller moderns MSC kan isoleras 22. Häri vi en detaljerad översikt över placenta anatomi och instruktioner om hur man specifikt dissekera decidua (moderns), chorionic villi (fetalt), och chorionic plattan (foster) vävnad (steg från 2,2 till 2,4). Därefter redogjorde vi en robust protokoll som gör det möjligt för MSC isolering från vart och ett av dessa tre vävnader (Steg 2,5-2,6). Placental MSC expansion är effektiv och kulturer likna härledd från benmärg MSC kulturer (figurerna 3 och 4). Osteogen differentiering är tillförlitlig (Figur 5B), medan adipogena differentiering är i allmänhet mindre effektiv (Figur 5C) 5.
Många nykomlingar till området kommer att förutsätta att kulturer härledda från fetal korionvilli eller chorionic platt vävnader kommer att berikas för foster MSC. Men i våra händer fetal cell anrikning är bara övergående när standard MSC expansionsmedium såsom DMEM-LG + 10% FBS utnyttjas 5. Här ger vi representativa resultat med hjälp av moderkakan vävnad som härrör från en manlig bebis. Genom att använda placenta vävnad från en manlig bebis, de fetala cellerna är lätt identifierbart ha XY kromosomer, medan maternella celler kan identifieras som har XX kromosomer. Figur 6 visar XY FISH resultat för en representativ kultur. Medan fetalt MSC (XY) är anrikade (upp till 80%) i de initiala kulturerna härledda från fetal korionvilli eller chorionic platt vävnader, är dessa samma kulturer snabbt overtaken (~ 100%) genom maternell (XX) MSC över de två första passager . I standardmedium sammansatt av DMEM-LG + 10% FBS, de få maternal härledda MSC som förorenar de fetala vävnader konkurrerar ut de fetala härledda celler i kultur.
Ett kritiskt steg som beskrivs i detta protokoll är en uppskattning av placenta anatomi och varifrån fosteroch maternell vävnad kan mest effektivt skördas. Som beskrivs i avsnittet Resultat företrädaren, dissektion av fostervävnad gör det möjligt gående anrikning för foster härrörande MSC. Förbättringar i expansionsmediumformulering, genom specifik exogen tillväxtfaktor mediet tillskott bör tillåta selektiv expansion av fetala härrörande MSC populationer, och tillverka en cellprodukt som är berikad för foster snarare än maternella celler (vår grupp utvecklar för närvarande sådana medel formuleringar). Tillverkningen av fetala MSC populationer kan ha ett antal fördelar, såsom fetalt MSC är påstås ha större angiogenes och immunsuppressiva egenskaper än motsvarande matern MSC populationer 37.
I vart och ett av de beskrivna isoleringsprotokoll, använde vi cirka 10 g vävnad. En hel placenta är typiskt 500-750 g, och i tidigare arbete vi visat att genom automatiserad vävnad Digest och en cellexpansion bioreaktor proccesser som det ska vara möjligt att tillverka mer än 7000 kliniska celldoser från en enda moderkakan 4. Dessa siffror markerar den potentiella lämpligheten placenta härrörande MSC i allogena MSC terapier, och betydelsen av denna metod oavsett MSC ursprung (foster eller moderns). Ur ett terapeutiskt perspektiv, är det mest kritiska att användarna har full förståelse för den cellprodukt och förmågan att på ett tillförlitligt sätt tillverka denna cellprodukt. Vi hoppas att vår video kommer att hjälpa forskarna att förstå placenta anatomi, isolera MSC från placenta, och förutse den sannolika foster eller maternell cellkomposition av deras kulturer.
The authors have nothing to disclose.
RP fick stöd av ett National Health och Medical Research Council (NHMRC) Forskar Training gemenskap. VS stöddes av University of Queensland International Forskarstuderande stipendium. MRD stöddes av NHMRC och Inner Wheel Australien.
Vi tackar klinisk och vårdpersonal för att bistå i patientens samtycke och provtagning. Vi tackar Prof. Nickolas Fisk, professor Kerry Atkinson och Dr Rohan Lourie för insiktsfulla diskussioner i obstetrik, feto-placental utveckling och placenta anatomi.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |