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Article de méthode

Non-retenue EEG télémesure: péridurale et Deep intracérébrale stéréotaxique EEG Placement des électrodes

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DOI :

10.3791/54216

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25 juin 2016

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1Department of Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM), 2Molecular and Cellular Cognition Lab, German Center for Neurodegenerative Diseases (Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen, DZNE)

Dans cet article

Résumé

Non-retenue EEG radiotélémétrie est une approche méthodologique précieux pour enregistrer les électroencéphalogrammes in vivo à long terme des rongeurs qui se déplacent librement. Ce protocole détaillé décrit péridurale stéréotaxique et le placement des électrodes intracérébrales profondément dans différentes régions du cerveau afin d'obtenir des enregistrements fiables de CNS rythmicité et des étapes comportementales liées au SNC.

Résumé

Radiotélémétrie implantable EEG est d'une importance centrale dans la caractérisation neurologique des modèles de souris transgéniques de maladies neuro-psychiatriques et les maladies neurodégénératives ainsi que des épilepsies. Cette technique puissante ne fournit pas seulement des indications précieuses sur les mécanismes physiopathologiques sous - jacents, à savoir., L'étiopathogénie des maladies liées au SNC, il facilite également le développement de nouveaux translationnelle, ie., Approches thérapeutiques. Considérant que des techniques concurrentes qui utilisent des systèmes d'enregistrement utilisés dans des vestes ou des systèmes captifs souffrent de leur retenue à caractère non physiologique semi-retenue, les enregistrements EEG radiotélémétrique surmonter ces inconvénients. Techniquement, implantable radiotélémétrie EEG permet une mesure précise et très sensible, EEGs intracérébrales péridurale et profondes dans diverses conditions physiologiques et physiopathologiques. Tout d'abord, nous présentons un protocole détaillé d'une avant droite, avec succès,technique rapide et efficace pour les enregistrements péridurale (surface) EEG résultant en electrocorticograms de haute qualité. Deuxièmement, nous montrons comment implanter profondes, des électrodes EEG intracérébrale, par exemple, dans l'hippocampe (electrohippocampogram). Pour les deux approches, un système informatisé 3D électrode d'implantation stéréotaxique est utilisée. L'émetteur radiofréquence lui-même est implanté dans une poche sous-cutanée chez les souris et les rats. Une attention particulière doit aussi être accordée à pré-, péri- et traitement post-opératoire des animaux de laboratoire. préparation préopératoire des souris et des rats, l'anesthésie appropriés ainsi que la gestion du traitement et de la douleur post-opératoire sont décrits en détail.

Introduction

Radiotélémétrie est une approche méthodologique plus utile pour mesurer une variété de paramètres comportementaux et physiologiques conscients, des animaux non de tailles différentes, en particulier dans le contexte de l' EEG, ECG, EMG, la pression artérielle, la température corporelle centrale ou des mesures d'activité 1-7. Théoriquement, toutes les espèces peuvent être analysées à l' aide implantable radiotélémétrie EEG des rongeurs de laboratoire tels que les souris et les rats à chats, les chiens, les porcs et les primates 3,8. Même les poissons, les reptiles et les amphibiens font l' objet d' une enquête radiotélémétrique 9. Au cours des deux dernières décennies, radiotélémétrie implantable selon l' EEG est avérée être utile dans la caractérisation des divers modèles animaux transgéniques de maladies humaines, telles que l' épilepsie, les troubles du sommeil, les maladies neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques 7,10-12. Dans le passé, de nombreuses approches méthodologiques de collecte des données physiologiques, y compris biopotentiels des souris et des rats ont été described. Porté dans les systèmes de veste de l' enregistreur, les méthodes de contention physique, radioémetteurs non implantés et des systèmes captifs ont reçu toute l'attention principale dans le passé 13,14. Aujourd'hui, divers systèmes pour l'implantation radiotélémétrique sont disponibles dans le commerce. Cependant, un écran de la littérature a également révélé 29 publications qui décrivent le développement de systèmes radiotélémétrique 15-40 self-made. Alors que les systèmes faits maison sont susceptibles d'être moins coûteux et plus facile à utiliser adaptés, commercialement systèmes disponibles sont simples, relativement facile à installer et peut être installé rapidement.

Implantable radiotélémétrie EEG a un certain nombre d'avantages par rapport aux techniques concurrentes telles que les méthodes de contention physique, porté dans les systèmes de veste ou d'approches attachés. Ces derniers sont par définition retenue, ie., L'animal est incapable de se déplacer ou de son comportement normal est altérée. Il pourrait même être nécessaire pour anesthésier l'animal pour l'acquisition de reles données susceptibles. systèmes captifs modernes sont toutefois susceptibles d'être moins restrictive, mais cela doit être validé scientifiquement. Télémesure d'autre part permet aux animaux d'exposer pleinement leur répertoire de comportements sans restrictions spatio - temporelles et donc, est considéré comme supérieur à restreindre les approches et être plus prédictive des résultats qui pourraient être acquises chez les humains 1,3. Il est connu pour un bon moment que les approches de retenue peuvent considérablement modifier les paramètres physiologiques fondamentaux, par exemple., La consommation alimentaire, la température centrale du corps, la pression artérielle et la fréquence cardiaque et de l' activité physique par exemple 3. Systèmes Tethered représentent l' approche d' une retenue classique encore largement utilisé 13,14. Les électrodes sont des électrodes soit épidurale ou profondes sont généralement connectés à une prise miniature qui est ancrée sur le crâne. La douille elle-même est exposée pour la fixation d'un câble qui permet un mouvement relativement libre de l'animal. AlthOugh aujourd'hui les systèmes captifs sont devenus extrêmement filigranes et très flexible, l'un de ses principaux inconvénients est, qu'il est encore semi-retenue. En outre, il pourrait y avoir un risque d'infection sur le site électrode d'implantation que les animaux ont tendance à manipuler les périphériques externes provenant de leur corps (tête). Bien que la technologie sans fil radiotélémétrie dans diverses espèces a déjà été décrite à la fin des années 60 et a donc existé pendant des décennies, il n'a que récemment devenu abordable, fiable et relativement facile à utiliser 10,41,42, en particulier chez les petits rongeurs de laboratoire tels comme les souris et les rats. Petits émetteurs miniatures EEG implantables sont maintenant disponibles dans le commerce et peuvent être implantées chez des souris supérieures à 20 g (~ 10 semaines). Ainsi, la caractérisation électrophysiologique des modèles de souris transgéniques, en particulier, est devenu un champ prédominant d'application de implantable radiotélémétrie EEG ces jours-ci. la taille des animaux est plus une restric expérimentale absoluetion alors que la durée de vie de la batterie des émetteurs est en effet. En dépit de sa durée de vie limitée, les systèmes d'émission implantables sont capables de minimiser la plupart des inconvénients liés au stress d'enregistrement associé potentiel par des systèmes de retenue. Les rongeurs peuvent présenter leur arsenal complet de comportement physiologique , y compris le repos, l' activité locomotrice (exploration) et le sommeil (REM, sommeil lent) 43,44. Fait important, la radiotélémétrie implantable peut fortement réduire l' utilisation des animaux 3. À l'heure actuelle, il y a une intense discussion sur la façon de limiter le nombre d'animaux de laboratoire en sciences et réduire leur souffrance. De toute évidence, l'expérimentation animale et les modèles animaux de maladies humaines et animales sont essentielles pour notre compréhension de la physiopathologie ligne de fond et de progrès ultérieurs dans la thérapie. En outre, les expérimentations animales sont essentielles dans la recherche et le développement de médicaments. Ils ne contribuent sensiblement à des études précliniques / toxicologiques dans l'homologation des médicamentsengageant ainsi à la fois les soins humains et des animaux. Il est à noter, qu'à l'heure actuelle aucune solution de rechange ne sont pas encore disponibles à la recherche des animaux pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes qui seraient autrement impossibles à être déclenchée. Dans le même temps, le 3R, ie., Le remplacement, la réduction et la stratégie de raffinement dans l'UE et aux Etats - Unis encourage fortement la recherche de méthodes alternatives et complémentaires. Télémesure est un exemple important d'une stratégie 3R réussie car elle peut réduire le nombre d'animaux de laboratoire et leurs souffrances par rapport aux autres techniques.

Ici, nous fournissons une approche détaillée et contigu étape par étape pour réaliser une poche implantation sous-cutanée d'un émetteur radiofréquence chez les souris et les rats. Cette première séquence est suivie d'une description de péridurale stéréotaxique et intracérébrale positionnement des électrodes EEG profonde. Une attention particulière est portée aux conditions de logement, l'anesthésie, péri- et la douleur postopératoirela gestion et un éventuel traitement anti-infectieux. L'accent est mis sur l'approche stéréotaxique 3D informatisée pour cibler de manière fiable les structures intracérébrales péridurale et profondes. Nous commentons également sur les pièges expérimentaux fréquents dans l'implantation d'électrodes EEG et des stratégies pour la réduction des traumatismes et de l'optimisation de la gestion de la douleur lors de la récupération postopératoire. Enfin, des exemples de surface et enregistrements EEG profonds sont présentés.

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Protocole

Déclaration éthique: Tout l'expérimentation animale a été réalisée selon les directives du Conseil local et institutionnel de protection des animaux (Université de Bonn, BfArM, LANUV, Allemagne). En outre, toute expérimentation animale a été réalisée conformément à la législation supérieure, par exemple., Communautés européennes Directive du Conseil du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE) ou individuelle législation régionale ou nationale. effort spécifique est fait pour réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés et de leur souffrance.

1. animaux d'expérimentation

  1. Sélection des animaux de laboratoire et des espèces
    1. Réaliser des études radiotélémétrique chez les rongeurs, ie., Les souris et les rats qui remplissent les conditions d'homologie, isomorphisme et la prévisibilité liés à une maladie humaine spécifique 7,9,45,46.
      Note: les souches Divers souris et de rat disponibles peuvent gravement différer physiologiques et physiopathologiques caractéristique etics 47-49.
    2. Considérez ou évaluer les caractéristiques physiologiques et physiopathologiques de souches de souris / rat avant d'effectuer des expériences électrophysiologiques subséquentes, par exemple, réponse à des doses d'anesthésiques applicables, l' architecture du sommeil et susceptibilité aux crises 50,51.
    3. Notez les caractéristiques spécifiques de genre dans la conception de l'étude. Le cycle oestral peut fortement affecter la rythmicité centrale, son activité dépendance circadien, le sommeil et la saisie 52-54. Ainsi, effectuer une analyse de genre spécifique.
      Note: Si la capacité financière et expérimentale est limitée, restriction à des souris mâles est conseillé.
  2. Logement des animaux et de la manutention
    1. les souris et les rats Maison à filtre-top cages ou mieux encore dans des cages individuellement ventilées.
    2. Transfert des souris de l'installation de l' animal à des armoires ventilées placés dans les salles de laboratoire spéciaux exclusivement réservés aux animaux implantés et leur enregistrement ultérieur (Figure1).
    3. Pour l' acclimatation après le transport au sol, placer les animaux pendant une semaine dans une armoire ventilée dans des conditions standard, à savoir, 21 ± 2 ° C de température ambiante, 50 -. Humidité relative de 60%, et à 12 heures de lumière cycle classique / sombre.
    4. Avant l'implantation chirurgicale, les souris domestiques dans des groupes de 3 - 4 en clair cages en polycarbonate de type II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, 410 cm 2) avec accès ad libitum à l' eau potable et des boulettes de nourriture standard. Utilisez clairement des cages en polycarbonate de type III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, 800 cm 2) pour les rats.
    5. Ne pas séparer / isoler les animaux à ce stade que l'isolement peut causer du stress influencer les résultats expérimentaux plus tard. Cependant, suite à l'instrumentation chirurgicale, les animaux de maison séparément comme les animaux ont tendance à manipuler la plaie stiches / sutures ou des agrafes métalliques (voir ci-dessous).
    6. Éviter les conditions ouvertes de logement comme ils sont jugés inappropriés pour une variété de sdes questions científic, par exemple., études sur le sommeil.
    7. Utilisez la souris et de l'équipement spécifique de rat de sorte que ni souris, ni les rats peuvent détecter la présence de l'autre que cela pose un stress supplémentaire pour les animaux.

2. EEG système télémesure

Remarque: Le protocole décrit est basé sur un système de télémétrie disponibles dans le commerce utilisés pour la surface et les enregistrements EEG intracérébrale profondes (figure 2).

  1. Utiliser un implant de télémétrie de radiofréquence adapté pour une implantation dans des souris ou des rats, par exemple., D' un émetteur à un canal ou d' un émetteur à deux canaux.
    Remarque:. Les deux émetteurs sont capables de mesurer divers biopotentiels, à savoir, l' électroencéphalogramme (EEG), un électrocardiogramme (ECG), électromyogramme (EMG), mais aussi l' activité physique et de la température. Ils disposent d'un mécanisme à commande magnétique de marche-arrêt. Les émetteurs et de détection fils sont fournis stériles. Si l'émetteur estêtre réutilisé suivre les instructions du fabricant pour la restérilisation.
  2. Pour l'analyse de gamma à haute fréquence (jusqu'à 500 Hz), par exemple, choisir des émetteurs avec des taux plus élevé nominal d'échantillonnage (f, jusqu'à 5000 Hz) et la bande passante de l'émetteur (B, jusqu'à 500 Hz). En particulier, tenir compte de la limite d'échantillonnage de Nyquist-Shannon, ie., Les données EEG peuvent être analysées jusqu'à un maximum absolu de f / 2, mais pas au - delà. Pour l'analyse de fréquence fiable, une largeur de bande de fréquence (B) de f / 10 - f / 5 est recommandée.
    Note: La question scientifique à traiter doit répondre aux spécifications techniques de l'émetteur.

3. Anesthésie et gestion de la douleur

  1. Utilisez isoflurane inhalation narcose.
    1. Placer l'animal dans une «chambre d'induction" rempli de 4-5% d' isoflurane et de 0,8 à 1% d' oxygène ou de carbogène (5% de CO 2 et 95% de O 2) L / min. Maintenir la profondeur désirée de l'anesthésie avec un masque de silicium offrant un débit de 1,5- 3,0% d' isoflurane et de 0,8 - 1% d' oxygène ou de carbogène L / min (figure 3A).
      Note: La concentration d'isoflurane approprié varie en fonction du poids corporel (volume de distribution), l'âge, le sexe et le fond génétique de l'animal. Si l' équipement d'anesthésie de gaz ne sont pas disponibles, à savoir, "chambre d'induction", carbogène ou l'apport d' oxygène, débitmètre, vaporisateur isoflurane, système de balayage, voir section 3.2. Un retiré par le système d'aspiration (balayage du système, la figure 3A) doit être installé afin d' éviter l' exposition à l' isoflurane de l'expérimentateur (le tube ne soit pas représenté dans le document vidéo pour la démonstration).
  2. Lorsque aneesthetics d'inhalation ne sont pas une option, effectuer une anesthésie par des anesthésiques injectables. Préparer un mélange de chlorhydrate esketamine (dosage de rongeur 100 mg / kg) et de chlorhydrate de xylazine (rongeur dose de 10 mg / kg) dans 0,9% de NaCl et injecter l'animal par voie intrapéritonéale sur la base de son poids corporel.
  3. Observer les animaux Carefully pour la profondeur de l'anesthésie à l'aide pincement de la queue, le pied presseur et en surveillant le taux de respiration (souris 150-220 respirations / min; rats 70 - 115 respirations / min). Vérifiez possible halètement.
    Remarque: des lignées de souris et de rat différentes peuvent présenter des sensibilités différentes à l'anesthésie. La même chose vaut pour les modèles de souris transgéniques.
    Remarque: L'intubation endotrachéale est pas un must chez les rongeurs. En effet, l'intubation augmente le risque d'endommager la trachée.

4. Instrumentation chirurgicale - Aspects généraux

  1. Appliquer la chaleur supplémentaire pendant et après la chirurgie en utilisant la recirculation des couvertures chaudes de l'eau, plaques chauffantes électriques, des lampes chauffantes, des unités à air pulsé chaud ou chaufferettes de poche pour maintenir la température centrale du corps. Maintenir ce dernier à 36,5 à 38,0 ° C (98,6 à 100,4 ° F).
    Note: Les petits rongeurs sont prédisposés à l' hypothermie en raison de leur rapport élevé de la surface du corps (de la souris, 10,5 x (poids en g) 2/3; rats, 10,5 x (poids en g) 2/3)le volume du corps.
  2. Évitez la dessiccation de la cornée et de couvrir les yeux avec artificielle pommade à base de pétrole de déchirure ou dexpanthénol (voir le document vidéo) pendant tout le processus d'implantation et de relèvement rapide jusqu'à ce que le réflexe de clignement est totalement restaurée.
  3. Instruments chirurgicaux autoclaves (voir le tableau des matériaux) pour la stérilisation ou les placer dans des désinfectants.
    Remarque: Une façon élégante et rapide est l'utilisation d'un stérilisateur d'instruments chirurgicaux à base de chaleur avec des perles de verre.
  4. Avoir un microscope à grossissement chirurgicale binoculaire et une source de lumière froide disponible pour un éclairage intense par l'intermédiaire, des guides de lumière mobiles flexibles ou autoportants.
  5. Porter une blouse de laboratoire propre, un masque, un couvercle de la tête et des gants stériles.
    Remarque: les fournitures et les instruments optimales peuvent varier d'un laboratoire à et doivent répondre à des exigences spécifiques au laboratoire et institutionnels.

5. Surgery - Transmetteur de placement

  1. Retirer le corps hair du cuir chevelu de totalement anesthésiés souris / rats en utilisant un rasoir. Nettoyez la zone rasée à l' aide d' un désinfectant, par exemple, 70% d' éthanol et un gommage à base d'iode. Eviter une irritation de la peau ou une inflammation due à une exposition excessive. Placer l'animal en position couchée sur une couverture chauffante pour maintenir la température du corps pendant l'anesthésie.
  2. L'utilisation d'un scalpel, faire une incision médiane sur le cuir chevelu du front (de sorte que le point de repère bregma craniométrique devient visible) au cou (de sorte que le muscle trapèze devient visible). A partir de l'incision à l'aide de la nuque et une paire de ciseaux chirurgicaux, ouvrir une poche sous-cutanée sur le flanc latéral de l'animal par dissection émoussé.
  3. Injecter 1 ml de NaCl 0,9% dans la poche sous-cutanée. Placez l'émetteur avec les fils de détection orientés crânialement l'intérieur de la poche sous-cutanée sur le flanc près de la région abdominale ventrale. Si l'émetteur a une patte de suture, fixer l'émetteur à la peau dorsale / latérale en utilisant un ou plusieurs stiChes (plus-et-plus de sutures).
    Notez que la fixation de l'émetteur est pas un must. Portez une attention particulière à la prévention de la contamination du site chirurgical et l'implant de l'émetteur. Tentures devraient être utilisés pour isoler correctement stérile des zones non stériles.
  4. Pour les soins post-opératoires et de gestion de la douleur, voir la section 8.

6. stéréotaxique Surface Electrode Implantation

  1. Placez l'animal sur le cadre stéréotaxique sous anesthésie et positionner soigneusement la tête avec l'aide des barres et la pince de nez de telle sorte que bregma et lambda craniometrics repères du crâne sont au même niveau (figure 3B). Ne pas endommager l'oreille interne en utilisant des barres d'oreille. Couvrir barres d'oreilles avec des boules de coton si nécessaire. Cette précaution permet une fixation étanche de la tête dans le cadre stéréotaxique.
  2. Nettoyez le périoste avec des conseils de coton sans endommager les muscles temporal et occipital. Pré-traiter la couche mince superficielle dele crâne avec 0,3% de H 2 O 2 pour le crâne de la souris et de 3% de H 2 O 2 pour le crâne du rat. Ce procédé expose clairement suture et des repères craniometrics crâniens tels que bregma et lambda (figure 4B, C).
  3. Utilisez une configuration stéréotaxique spéciale, entièrement équipée pour les souris et les rats, y compris cadre stéréotaxique avec des barres d'oreille et la taille adaptée pour les souris et les rats, respectivement nez pince. Assurez-vous que le cadre stéréotaxique comprend un masque d'anesthésie au gaz avec des connexions à l'évaporateur isoflurane et le module de piégeur isoflurane.
    Remarque: Une configuration stéréotaxique 3D informatisée avec une souris et de cerveau de rat spécifique de coordonnées logiciel comprenant une interface utilisateur pour la navigation et l'atlas 3D, ce qui permet des vues axiales, coronales et sagittales est recommandé.
  4. Monter un semoir de précision sur le bras vertical du cadre stéréotaxique. Utilisez un crayon ou un stylo monté sur le bras vertical en laissant une petite marque aux coordonnées de choix sur le dessus du crâne siaucun système stéréotaxique informatisé est disponible.
  5. Percer avec soin en tenant compte du fait que les souris et les rats diffèrent fortement dans l'épaisseur de l'os neurocranial. En outre, notez que l'épaisseur des os du crâne murins dépend fortement de la localisation, par exemple, chez la souris, os frontale: section médiane: 320-390 um, section latérale: 300-430 um; os pariétal: section médiane: 210 - 250 um, section latérale: 200-210 um; os occipital: section médiane: 600-730 um, section latérale: 380-420 um).
  6. Les trous de forage sans pression à la vitesse maximale.
    Note: Ceci évite un aplanissement tonique du crâne, ce qui peut entraîner une percée soudaine de la tête de forage et les dommages potentiels principalement dans le domaine corticale. Pour craniotomie, un système de forage de moteur de précision à grande vitesse neurochirurgicale est fortement recommandé.
  7. Percez des trous de trépan aux coordonnées de choix avec diamètre de la tête de forage typiquede 0,3 - 0,5 mm.
    Note: Le diamètre des trous peut être inférieure en fonction du diamètre de l'électrode. En règle générale, plus le diamètre, le moins de dégâts est produit.
  8. Pliez la pointe du fil de détection des émetteurs qui sert d'électrode épidurale et le placer directement sur la dure-mère dans le trou aux coordonnées de choix. Vous pouvez également utiliser des vis corticales et mécaniquement les attacher à des fils de détection de l'émetteur (figure 4A).
  9. . Pour les enregistrements à partir de la surface, par exemple, le cortex moteur murin M1 / M2, positionner l'électrode, par exemple, à: crânienne 1 mm, latéral 1,5 mm (hémisphère gauche). Placez l'électrode de référence péridurale sur le cortex cérébelleux: bregma -6 mm, latéral de bregma 1 mm (hémisphère gauche) ou bregma -6 mm, latéral de bregma 1 mm (hémisphère droit) (Figure 4D).
    Remarque: Le cervelet sert de référence car il est une région electroencephalographically silencieuse. StereotLes coordonnées axic peuvent être obtenus à partir des atlas stéréotaxique standard pour les souris et les rats.
  10. Fixer avec des électrodes de verre ionomère ciment dentaire (à base d'eau), ce qui est extrêmement difficile et donne une forte adhérence au neurocrâne sous-jacente.
    Remarque: Si ciment verre ionomère dentaire est utilisé, aucune vis d'ancrage sont nécessaires pour fixer les électrodes.
  11. Laisser le ciment sécher pendant 5 min. Fermez le cuir chevelu avec plus-et-plus de sutures avec des non-absorbable 5-0 / 6-0 matériel de suture. Alternativement, la colle de peau peut être utilisée. Surveiller de près la qualité des enregistrements EEG basés sur le site électrode d'implantation. Note: ossification des trous forés peut se produire qui a la capacité de soulever les électrodes avec le temps. Cela peut entraîner une diminution de la qualité d'EEG en raison de la contamination de l'EMG et de l'ECG et peut ainsi limiter la durée d'enregistrement optimale.
  12. Pour les soins post-opératoires et de gestion de la douleur, voir la section 8.
  13. Valider EEG position de l'électrode post-mortem.
    1. Pour l'euthanasiePlacez l'animal (s) dans une chambre d'incubation et d'introduire 100% de dioxyde de carbone. Utiliser un taux de remplissage de 10% - 30% du volume de la chambre par minute avec du dioxyde ajoutée à l'air existant dans la chambre d'incubation de carbone. Ceci est approprié pour atteindre une perte de conscience rapide de détresse minimale pour les animaux.
      Remarque: Éviter l'exposition soudaine des animaux conscients à des concentrations de dioxyde de carbone> 70% que cela a été montré pour être pénibles.
    2. Observez chaque souris / rat par manque de respiration et de la couleur des yeux fané. Maintenir flux de CO 2 pour un minimum de 1 min après l' arrêt respiratoire. Heure prévue à l'inconscience est généralement en 2 à 3 min.
    3. Si les deux signes sont observés, puis retirez les rongeurs de la cage; sinon continuer à les exposer au CO 2. Si la perte de conscience n'a pas eu lieu dans les 2 à 3 min, vérifier le taux de remplissage de la chambre.
    4. Pour vérifier le placement correct des électrodes, extirpent cerveaux post mortem, par exemple., Suivant CO 2 l' euthanasie et les fixer à 4% de paraformaldehyde dans du PBS (pH 7,4) pendant la nuit. En variante, effectuer la perfusion cardiaque des animaux en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS; pH 7,4), suivie de 4% de paraformaldehyde (PFA) dissous dans une solution de PBS.
    5. cerveaux Postfix pour 2-4 heures dans 4% PFA à TA suivis par cryoprotection dans 30% de saccharose dans du PBS et les cerveaux des magasins à 4 ° C jusqu'à un traitement ultérieur.
    6. Utilisation de la matrice de l'échantillon pour cryostat tronçonnage, de geler le cerveau sur un bloc stéréotaxique et couper 60 um coupes coronales en utilisant un cryostat. Monter les tranches sur des lames de verre, l'air sec, et la tache avec du bleu Nissl en utilisant des techniques standard pour visualiser le canal de dérivation et ancienne position de l'électrode.
      Remarque: Cette approche révèle également si les électrodes de surface ont été placés au fond accidentellement en laissant un impact mineur sur la partie supérieure du cortex.

7. stéréotaxique intracérébrale profonde EEG Electrode Implantation

  1. Pré-traiter le cuir chevelu et le crâne de l'animal tel que décrit dans les sections 6.1 - 6.2. Sélectionnez le type d'électrodes profondes soigneusement, en prenant en considération ses caractéristiques matérielles, par exemple., Le diamètre et l' impédance et possible la connexion à fils de détection de l'émetteur.
    Note: Parylène acier revêtu et de tungstène électrodes sont couramment utilisés. Les caractéristiques d'électrodes doivent répondre aux besoins expérimentaux individuels. Si les électrodes ne sont pas fournies stériles, ils doivent être mis en incubation dans 70% d'éthanol avant utilisation. Comme les électrodes sont revêtues à cet effet expérimental, une stérilisation à base de chaleur ne sont pas applicables.
  2. Percer des trous aux coordonnées de choix, comme décrit dans la section 6 en utilisant le système stéréotaxique. Pour cibler la région CA1 murin par exemple, qui sert de zone du cerveau intensivement étudiée, placer l'électrode différentielle aux coordonnées suivantes faisant référence au bregma: caudale 2 mm, latéral 1,5 mm (hémisphère droit)et dorso-ventral (profondeur) 2 mm. Placez une électrode de référence péridurale sur le cortex cérébelleux, par exemple., Bregma -6 mm, latéral de bregma 1 mm ( à gauche ou à droite hémisphère) (Figure 4D, E).
    Remarque: L'électrode cérébelleuse sert une électrode pseudo-référence sur la région silencieuse du cervelet. Les coordonnées stéréotaxiques peuvent être obtenus à partir des atlas stéréotaxique standard pour les souris et les rats.
  3. Raccourcir les électrodes profondes à la longueur voulue en fonction de la profondeur dans le cerveau, ils seront insérés. Relier la partie extracrânienne de l'électrode à l'hélice du conducteur d'émetteur de l'acier inoxydable en pliant les deux parties à un angle de 90 ° entre les deux.
  4. Clips l'électrode profonde au fil de détection de l'émetteur mécaniquement. Ne pas souder chaque fois que possible, car cela peut provoquer un bruit important dans l'enregistrement EEG. Exposer l'hélice du conducteur d'émetteur en acier inoxydable en enlevant une courte section de l'isolation de silicone externe au niveau de la pointe dele conducteur de l'émetteur à l'aide d'une lame de scalpel stérile.
  5. Rewire la tête de l'émetteur à l'électrode cérébrale profonde. Assurer une connexion appropriée et stable des deux composants (Figure 4F). Attacher l'électrode implantée (qui est relié mécaniquement à la tête de l'émetteur) au bras vertical du dispositif stéréotaxique.
  6. Fixer l'électrode avec ciment verre ionomère dentaire (à base d'eau), ce qui est extrêmement difficile et donne une forte adhérence au neurocrâne sous-jacente. Laisser le ciment sécher pendant 5 min. Fermez le cuir chevelu avec plus-et-plus de sutures avec des non-absorbable 5-0 / 6-0 matériel de suture. Alternativement, la colle de peau peut être utilisée.
  7. Surveiller de près la qualité des enregistrements EEG basé sur le côté électrode d'implantation.
    Note: ossification des trous forés peut se produire qui a la capacité de soulever les électrodes avec le temps. Cela peut entraîner une diminution de la qualité EEG en raison de la contamination de l'EMG et ECG et peut ainsi limiter la rec optimaledurée de ording. Ceci est d'une importance particulière pour le placement des électrodes profondes.
  8. Pour les soins post-opératoires et de gestion de la douleur, voir la section 8.
  9. Valider EEG placement des électrodes post-mortem comme décrit dans la section 6.13.

Soins 8. post-opératoire et la gestion de la douleur post-opératoire

  1. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
  2. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
  3. Pour la gestion de la douleur post-opératoire, choisir un médicament de l' un des groupes suivants: les opiacés narcotiques, opioïdes agonistes / antagonistes, a 2 -agonistes, l' anesthésie locale et les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) 55-60 S'il vous plaît noter qu'en raison de. la gravité de la chirurgie d'un traitement analgésique de 3 jours est recommandable.
    1. En cas d'utilisation de la buprénorphine, administrer la dose suivante: la souris: 0,05- 0,1 mg / kg, ip, sc, tous les 6 - 12 heures; rat: de 0,01 à 0,05 mg / kg, ip, sc, toutes les 8 - 12 heures.
    2. Si vous utilisez butorphanol, administrer la dose suivante: la souris: 1.0 - 5.0 mg / kg, sc, toutes les 4 heures; rat: 2,0 à 2,5 mg / kg, sc, toutes les 4 heures.
    3. Si vous utilisez le tramadol, administrer la dose suivante: souris, rat: 10 - 30 mg / kg, ip
    4. Si vous utilisez flunixine, administrer la dose suivante: la souris: 2,5 mg / kg, sc, toutes les 12 h; rat: 1.1 mg / kg, sc, toutes les 12 heures.
    5. Si vous utilisez le kétoprofène, administrer la dose suivante: la souris: 5 mg / kg, sc, toutes les 12-24 heures; rat: 5 mg / kg, sc, toutes les 12-24 heures.
    6. Si vous utilisez metamizole, administrer la dose suivante: souris, rat: 100 mg / kg, ip, toutes les 8 heures.
    7. Si vous utilisez meloxicam, administrer la dose suivante: souris, rat: 1 mg / kg sc, toutes les 24 heures.
    8. Si vous utilisez carprofène, administrer la dose suivante: la souris: 5-10 mg / kg, sc, toutes les 12-24 heures; rat: 2,5 à 5,0 mg / kg, sc, toutes les 12-24 heures.
    9. Si vous utilisez acetaminophen, administrer la dose suivante: la souris: 300 mg / kg, po, toutes les 4 heures; rat: 100 - 300 mg / kg, toutes les 4 heures.
    10. Si vous utilisez lidocaïne (comme analgésique adjuvant), administrer la dose suivante: souris, rat: 1 - 4 mg / kg sc
  4. Lorsque vous utilisez carprofène (dosage de rongeur 5-10 mg / kg sc, dilué dans NaCl à 0,9%) pour la gestion de la douleur de longue durée post-opératoire, effectuer l'injection initiale de 10 - 15 min avant la fin de l'instrumentation chirurgicale et répéter pour deux subséquente jour une fois par jour.
  5. Après l'opération, nourrir granulés humidifiés afin de faciliter l'absorption des aliments. Observer attentivement la nourriture (~ 15 g / 100 g / j; ~ 5 g / 24 h) et de l'eau (~ 15 ml / 100 g / j; ~ 5 ml / 24 h) la consommation.
  6. Surveiller les animaux de près pour le retour de leurs postures et comportements normaux.
    Note: L'administration systémique d'antibiotiques tels que l'enrofloxacine ou triméthoprime-sulfamides est souvent recommandé, mais pas une nécessité absolue, à moins de signes inflammatoires de méningite ou une encéphalite à the sites d'implantation sont détectés.
  7. Donner des souris au moins 10 à 14 jours supplémentaires pour récupérer complètement avant de commencer les enregistrements EEG pour une analyse ultérieure.
    Remarque: Les tâches expérimentales spécifiques peuvent nécessiter des périodes de récupération plus longues.
  8. Suivi récupération post-opératoire après l'implantation en évaluant le développement post-chirurgicale de poids corporel. Une réduction maximale du poids corporel est normalement observée autour du jour 4 - la chirurgie 5 post suivie d'une augmentation légère, mais constante du poids pendant 10 - période de récupération de 14 jours.

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Résultats

Cette section présente des exemples obtenus à partir de la surface et de profondeur, enregistrements EEG intracérébrale. Initialement , il convient de préciser que les enregistrements de base dans des conditions physiologiques sont obligatoires avant les enregistrements ultérieurs suivants , par exemple, le traitement pharmacologique. Ces enregistrements de base peuvent fournir des informations précieuses sur l'interdépendance fonctionnelle du cerveau rythmicité avec différe...

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Discussion

Implantable radiotélémétrie EEG est d' une importance centrale car elle est une technique non-retenue permettant des animaux de laboratoire pour effectuer leur répertoire complet du comportement 1,3. Ceci est d'un intérêt majeur que l'approche télémétrique permet non seulement des enregistrements EEG spontanée, mais aussi des enregistrements sous tâches cognitives et configurations analytiques circadiens, tels que T-labyrinthe, labyrinthe radial, labyrinthe d'eau, les tâches de privation de so...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la Dre Christina Ginkel (Centre allemand pour les maladies neurodégénératives, DZNE), la Dre Michaela Möhring (DZNE) et le Dr Robert Stark (DZNE) pour leur aide dans l’élevage et les soins de santé animale. Ce travail a été soutenu financièrement par l’Institut fédéral des médicaments et des dispositifs médicaux (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM) Bonn, Allemagne.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Carprofène (Rimadyl VET - InjektionA2 :D43slö ; sung)PfizerPZN 011020820 ml
Microscope à grossissement chirurgical binoculaire  ;Zeiss Stemi 20000000001003877, 435540000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Bulldog serrefineF.S.T.18051-2828 mm
Cages (Macrolon)Techniplast1264C, 1290D
Source de lumière froideSchott KL2500 LCD9.705  ; 202commandés chez Th.Geyer
Applicateurs à embout en coton (stériles)Carl Roth  ;EH12.1
Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe)BayerPZN : 1578818
Champs (stériles)HartmannPZN 0366787
70 % d’éthanolCarl Roth  ;9065.5
Solution de peroxyde d’hydrogène à 0,3 %/3 %Sigma95321Solution mère à 30 %  ;
Gants (stériles)Unigloves1570
Dental glas ionomer cementKentDental /NORDENTA957 321
2 % glutaraldehyde solutionSigmaG6257
Graefe Forceps-courbé, denteléF.S.T.11052-10
Halsey Micro Porte-Aiguille-Carbure de TungstèneF.S.T.12500-1212,5 cm
Stérilisateur d’instruments chirurgicaux à base de chaleurF.S.T.18000-50
Coussin chauffantAEG HK5510520010commandé chez myToolStore
Foret dentaire à grande vitesseAdeorSI-1708
Ciseaux à iris extra fin  ;F.S.T.14058-099 cm
Système narcotique par inhalation (isoflurane)Harvard Apparatus GmbH34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230
IsofluraneBaxter 250 mlPZN 6497131
KétaminePfizerPZN 07506004
Lactate Ringer' s solution (stérile)BraunL7502
Lexar-Baby Scissors-droit, 10 cmF.S.T.14078-1010 cm
Nissl staining solutionArmin BaackBAA31712159
Matériau de suture non résorbable 5-0/6-0 (stérile)SABANA (Sabafil)N-63123-45
Covidien (Sofsilk)S1172, S1173
Halsey Porte-aiguilleF.S.T.12001-13
Coussinets de 13 cm (stérile)ReWa Krankenhausbedarf2003/01
0,9 % de solution saline (NaCl, stérile)BraunPZN :8609255
Lames de scalpel avec manche (stérile)propraxis2029/10
Pince à motif standardF.S.T.11000-12, 11000-1412 cm et 14,5 cm de longueur
Électrodes en acier et tungstène revêtues de parylène  ;FHC Inc., États-Unis)UEWLGESEANND
Châssis stéréotaxiqueNeurostar51730Mcommandé chez Stoelting
(Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic)
Bandes (stériles)BSN medical GmbH & Co. KG626225
  ;DSI270-0042-001XTransmetteur radiofréquence 3,9 g,  ;
3,9 g, 1,9 ml, plage de tension d’entrée ± ; Largeur de bande de canal 2,5 mV,
(B) 1 - 200 Hz,  ; < fréquence d>'échantillonnage nominale (f) 1 000 Hz (f = 5 B)< >plage de température de fonctionnement 34 - 41 ° 34 - 41 ° ° C
autonomie garantie de la batterie 4 mois
TL11M2-F20EET  ;DSI270-0124-001XTransmetteur de radiofréquence  ;
3,9 g, 1,9 ml, plage de tension d’entrée ± ; Largeur de bande de canal de 1,25 mV,
(B) 1 - 50 Hz,  ;
fréquence d’échantillonnage nominale (f) 250 Hz (f = 5B)
plage de température de fonctionnement 34 - 41 ° ; C
autonomie garantie 1,5 mois
Pince à tissus - 1x2 dents 12 cmF.S.T.11021-1212 cm de longueur
Ciseaux à iris en carbure de tungstèneF.S.T.14558-1111,5 cm
Vibroslicer 5000 MZMicroscopie électronique Sciences5000-005
Xylazine (Rompun)BayerPZN : 1320422
TA10ETA-F20

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