Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Summary

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Abstract

La mitose est critique pour la croissance de organismal et la différenciation. Le processus est très dynamique et nécessite ordonné des événements pour accomplir la condensation appropriée de la chromatine, l'attachement des microtubules-kinétochore, la ségrégation des chromosomes, et la cytokinèse dans un petit cadre de temps. Des erreurs dans le délicat processus peut entraîner des maladies humaines, y compris des malformations congénitales et le cancer. Les approches traditionnelles de l'enquête états pathologiques mitotique humains reposent souvent sur des systèmes de culture cellulaire, qui manquent de la physiologie naturelle et contexte de développement / tissu-spécifique avantageux lors de l'étude des maladies humaines. Ce protocole permet de surmonter de nombreux obstacles en fournissant un moyen de visualiser, avec une haute résolution, la dynamique des chromosomes dans un système de vertébrés, le poisson zèbre. Ce protocole détaille une approche qui peut être utilisée pour obtenir des images dynamiques de cellules en division, qui comprennent: la transcription in vitro, l' élevage du poisson zèbre / collecte, embryon plongement et imagerie time-lapse. Optimisation et modifications de ce protocole sont également explorées. Utilisation de H2A.F / Z-EGFP (étiquettes chromatine) et mCherry-CAAX (de la membrane cellulaire des étiquettes) des embryons d'ARNm-injecté, mitose dans de type sauvage AB, auroraB ^hi1045 et ^hi2865 de esco2 zebrafish mutant est visualisé. Imagerie haute résolution en direct chez le poisson zèbre permet d'observer plusieurs mitoses à quantifier statistiquement défauts mitotiques et le timing de la progression mitotique. En outre, l' observation des aspects qualitatifs qui définissent les processus inappropriés mitotiques ( par exemple, des défauts de congression, de chromosomes mauvaise ségrégation, etc.) et les résultats chromosomiques incorrecte (ie, aneuploïdie, polyploïdie, micronoyaux, etc.) sont respectées. Cet essai peut être appliqué à l'observation de la différenciation tissulaire / développement et se prête à l'utilisation du poisson zèbre mutant et agents pharmacologiques. Visualisation de la façon dont les défauts en mitose conduisent à des troubles du cancer et de développement sera grandementaméliorer la compréhension de la pathogenèse de la maladie.

Introduction

La mitose est un processus essentiel du cellulaire critique pour la croissance, la différenciation et la régénération dans un organisme vivant. Lors de la préparation précise et la réplication de l'ADN en interphase, la cellule est amorcée à se diviser. La première phase de la mitose, la prophase, est initiée par l'activation de la cycline B / Cdk1. Prophase est caractérisé par la condensation de la matière de la chromatine dans les chromosomes. répartition de l'enveloppe nucléaire se produit à la transition entre prophase et prométaphase. Dans prométaphase, centrosomes, le centre de nucléation pour la formation du fuseau, commencent à migrer vers les pôl....

Protocol

1. Transcription in vitro

1. Linéariser pCS2-H2A.F / Z-EGFP et / ou vecteurs pCS2-mCherry-CAAX par restriction Notl enzyme digérer ^31. L' utilisation d' un ARN dans le kit de transcription in vitro, de générer des produits 5 'd'ARNm coiffés à partir de chaque modèle, selon le protocole du fabricant.
2. Purifier l'ARNm coiffés en utilisant un kit de purification. Suivez les instructions du fabricant. Eluer avec RNase-H ₂ O.
3. Déterminer la concentration d'ARN par absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. (DO ₂₆₀ x dilution x 40 ug / ml).
4. Di....

Results

La figure 2 montre la capacité d'observer de nombreuses divisions cellulaires en utilisant une large vue d'un AB de type sauvage queue de poisson zèbre champ. Plus de sept cellules en mitose sont imagés dans un laps de temps de 14 min (Movie 1). Dans les deux heures de temps bien sûr, plus de 40 événements mitotiques ont été capturés. En moyenne, 50 cellules en division ont été observées dans l'AB et 30 cellules qui se divisent en aur B

Discussion

L' utilisation de ce procédé permet de déduire une rupture de l' enveloppe nucléaire, la formation d'une plaque métaphase par des attaches microtubules kinétochore, et la ségrégation des chromatides sœurs pour former deux nouvelles cellules in vivo et d'une manière dépendante du temps. La capacité à observer mitose chez le poisson zèbre est avantageuse par rapport à des échantillons fixes et des systèmes de culture cellulaire, car les cellules sont imagées dans la physiologie naturelle, le tissu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vecteurs pCS2	Don de K. Kwan		Pour le plasmide d’intérêt Enzyme de
restriction NotI-HF	New England BioLabs	R3189S	Pour la digestion de restriction du plasmide
mMessage SP6 kit	Life Technologies	AM1340	Pour la transcription in vitro
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104	Pour purifier l’ARNm
100 x 15 mm Boîtes de Pétri	Fisher Scientific	FB0875712	Pour l’hébergement des embryons moule
micro-injection	fait maison		Pour maintenir les embryons lors de la micro-injection
Agarose II	Amresco	0815-25G	Pour l’enrobage des embryons
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521-10G	Pour anesthésier les embryons
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S9888	Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans UltraPure H2
O Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P3911	Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans UltraPure H2
O Chlorure de calcium dihydrate	Sigma-Aldrich	C8106	Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans UltraPure H2
O Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M7506	Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans un tube de culture UltraPure H>2O
Methylene Blue Hydrate	Sigma-Aldrich	MB1	Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans un tube de culture de 100 mm UltraPure HO
	Fisher Scientific	50-819-812	Pour gélose fondue
Plat de culture à fond de lamelle en verre de 35 mm  ;	MatTek Corp	P35G-0-20-C  ;	N° 0, verre de 20 mm, pour l’enrobage d’embryons
#5 pince à épiler	Dumont	72701-D	Pour déchorionner les embryons
21 G Aiguille de calibre 1 1/2	Becton Dickinson	305167	Pour positionner les embryons dans un
microscope de dissection	Nikon AZ100		Pour le dépistage et l’intégration d’embryons, n’importe quelle lunette de dissection fera l’affaire
Microscope confocal	Nikon A1+		Pour l’imagerie en accéléré
Logiciel confocal	NIS Elements AR 4.13.00		Pour l’acquisition et le traitement d’images