Наблюдение за митотического деления и динамика в живом данио Эмбрион
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
Митоз имеет решающее значение для роста и дифференцировки организменном. Процесс является очень динамичным и требует упорядоченный событий для достижения надлежащего конденсацию хроматина, микротрубочек кинетохор привязанность, расхождение хромосом и цитокинез в небольшой промежуток времени. Ошибки в деликатном процессе может привести к болезни человека, в том числе врожденных дефектов и рака. Традиционные подходы, расследующие болезненных состояний митотический человека часто полагаются на системах клеточных культур, которые испытывают недостаток естественной физиологии и развития / контекст тканеспецифичную выгодный при изучении болезней человека. Этот протокол позволяет преодолеть многие препятствия, предоставляя способ визуализации с высоким разрешением, динамики хромосом в системе позвоночных, данио. Этот протокол будет подробно подход , который может быть использован для получения динамических изображений делящихся клеток, которые включают в себя: в пробирке транскрипции, данио разведения / сбора, эмбрион вложения и покадровой обработки изображений. Оптимизация и MODIFications этого протокола также исследуются. Использование H2A.F / Z-EGFP (маркирует хроматин) и mCherry-CAAX (метки клеточных мембран) мРНК-впрыскивается эмбрионов, митоз в АВ дикого типа, auroraB hi1045 и esco2 hi2865 мутанта данио визуализируется. Высокое разрешение изображения в прямом эфире в данио позволяет наблюдать множественные митозы статистически количественно митотические дефекты и сроки митоза. Кроме того, наблюдается наблюдение качественных аспектов , которые определяют неправильные процессы митоза (т.е. congression дефекты, missegregation хромосом и т.д.) и результаты неправильного хромосомные (т.е. анеуплоидии, полиплоидия, микроядер и т.д.). Этот анализ может быть применен к наблюдению тканевой дифференцировки / развития и поддается использованию мутанта данио рерио и фармакологических агентов. Визуализация как дефекты в митозе привести к раку расстройствами и нарушениями развития будет в значительной степениспособствовать более глубокому пониманию патогенеза заболевания.
Introduction
Митоз является критическим ячеистый основной процесс роста, дифференцировки и регенерации в живом организме. После точной подготовки и репликации ДНК в интерфазе, клетка грунтуется разделить. Первая фаза митоза, профазы, инициируется активацией циклин B / Cdk1. Профаза характеризуется конденсацией хроматина материала в хромосомы. пробой ядерной оболочки происходит при переходе между профазе и прометафазе. В прометафазе, Центросомы, Нуклеирующий центр для формирования веретена, начинают мигрировать к противоположным полюсам при расширении микротрубочки в поисках прикрепления кинетохор. После присоединения, преобразования к конечным прикомандирован микротрубочек и натяжной силы ориентировать хромосомы , образующие метафазного пластину 1. Если все хромосомы прикреплены правильно, узел шпинделя контрольной точки выполняется, Cohesin кольца, удерживающие сестринские хроматиды вместе расщепляются, и микротрубочки сократить тянуть сеструхроматиды к полюсам во время анафазы 2,3. На заключительном этапе, телофаза, включает в себя удлинение клетки и реформирования ядерной оболочки вокруг двух новых ядер. Цитокинез завершает процесс разделения путем разделения цитоплазмы двух новых дочерних клеток 4-6. Изменение ключевых митотических путей (т.е. шпинделя сборки контрольно – пропускном пункте, центросомы дублирования, сестринских хроматид сцепления и др.) Может привести к метафазе аресту, missegregation хромосом и геномной нестабильности 7-10. В конечном счете, дефекты путей распространения контрольного митоза могут вызвать нарушения развития и рака, что вызывает необходимость визуализации митоза и его дефекты в живом, позвоночное, многоклеточного организма 10-16.
Эмбрионы рыбок данио служить отличным модельного организма для живого изображения благодаря прозрачной ткани, легкость микроинъекции, и быстрое развитие. Использование данио, общая цель этой рукописи являетсяописывают способ живой 5D (размеры X, Y, Z, время и длина волны) визуализации митоза 17 (рис 1C). Использование мутанта данио дефектного в различных митотических путей демонстрируют последствия таких дефектов. Для этого протокола, были выбраны Aurora B и Esco2 мутанты, чтобы проиллюстрировать эти дефекты. Aurora B является киназа, которая является частью хромосомы пассажирского комплекса (КПК), участвующих в формировании веретена и прикрепления микротрубочек. Он также необходим для формирования расщепления борозды в цитокинезе 18,19. В данио, дефицит Aurora B ведет к дефектам по бороздам индукции, цитокинеза и сегрегации хромосом 20. Esco2, с другой стороны, является ацетилтрансферазы , что имеет важное значение для сестринских хроматид когезии 21,22. Он ацетилирует Cohesin на SMC3 части кольца , таким образом , стабилизирующего Cohesin для обеспечения правильной сегрегации хромосом в метафазе-анафазе перехода 23. Потеря Esco2 в данио приводит к спromosome missegregation, преждевременные сестра разделения хроматид, геномная нестабильность и p53-зависимые и независимые апоптозом 24,25. Благодаря наличию, auroraB hi1045 и esco2 hi2865 мутанта данио (далее именуемые как aurB м / м и esco2 м / м, соответственно) будет использоваться для иллюстрации этого метода 25-27.
Муфта конфокальной микроскопии с флуоресцентно меченых клеток машин позволило исследователям визуализировать хроматина и клеточной мембраны динамика во время митоза 25,28,29. Флуоресцентные меченных гистонов исторически использовались для визуализации хроматина. Гистоны ядерные белки , состоящие из четырех различных пар (H2A, H2B, H3 и H4), которые ответственны за структуры нуклеосомы , которые сочиняет хромосомы 30. В то время как Н2В, возможно, является наиболее часто используемым гистонов для флуоресцентных белков вмышь и культура клеток, использование Гистона 2А, Семейный Z (H2A.F / Z) доказал , хорошо для использования в данио 31,32. Конканавалин А и казеин – киназы 1-гамма, например, локализовать на клеточной мембране , и как было показано ранее эффективными в визуализацией через клеточную мембрану в морских ежей и Drosophila 33,34. Другие исследования показали , что CAAX флуоресцентно меченый белок этикетки клеточную мембрану и была успешной в данио 31. CAAX является мотив, который признан посттрансляционными модифицирующих ферментов, таких как farnesyltransferases и geranylgeranyltransferases. Изменения этими ферментами вызывают белки , чтобы стать ассоциированный с мембранами, таким образом маркируя клеточную мембрану 35.
В связи с предшествующим уровнем использования в данио рерио, этот протокол решили использовать H2A.F / Z и CAAX маркировать хроматин и клеточную мембрану. Применение этого метода позволит исследователя контролировать митоза на уровне отдельных клеток, чтобы наблюдать отдельные хромосомыдинамика, а также одновременно контролировать несколько клеточных делений, которые могут повлиять на тканевой дифференцировки и развития. В данной статье основное внимание будет уделено визуализации динамики сегрегации хромосом во время митоза на уровне отдельных клеток. В этой рукописи, способность наблюдать несколько митотических делений, вычислить время деления, и расшифровать митотического фенотипы будут проиллюстрированы и обсуждены. Используя эти параметры, физиологически соответствующие данные могут быть собраны и применены к нескольким болезненных состояний, пострадавших от митотических дефектов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование этого метода позволяет сделать вывод о разбивку ядерной оболочки, образование метафазы пластины микротрубочек-кинетохора вложения и сегрегации сестринских хроматид с образованием двух новых клеток в естественных условиях и в зависимости от времени способом. Спос…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd, ., J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O’Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
