VacuSIP, en förbättrad Inex metod för<em> In Situ</em> Mätning av partikel och lösta föreningar bearbetade Active suspensionsätare

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Bentiska suspensionsätare spelar viktiga roller i funktion marina ekosystem ^1. Genom att filtrera stora mängder vatten ^2,3, de tar bort och utsöndrar partiklar (plankton och smuts) och lösta föreningarna ¹ (och referenser däri) och är en viktig agent för bentiska-pelagiska koppling ^4,5 och närings cykling ^6,7. Noggrant mäta partikel och lösta föreningar avlägsnas och utsöndras av botten suspensionsätare (t.ex. svampar, sjöpungar, havsborstmaskar och musslor) är grundläggande för att förstå deras fysiologi, metabolism och utfodring ekologi. Tillsammans med pump mätningar ränta gör det också en kvantifiering av näringsflödena förmedlade av dessa organismer och deras ekologiska påverkan på vattenkvaliteten samt ekosystem skala processer.

Att välja en lämplig metod för att mäta borttagning och produktionstakten av partiklar och upplösta compounds per upphängnings filtrerare är avgörande för att erhålla tillförlitliga uppgifter om sin näring ^8. Som påpekats av Riisgård och andra olämpliga metoder partiskhet resultat, snedvrider experimentella betingelser, ge felaktiga uppskattningar av intag och utsöndring av vissa ämnen, och kan leda till felaktig kvantifiering av näringsflödena behandlas av dessa organismer.

De två vanligaste använda metoderna för att mäta partiklar och lösta näringsämnen flöden i filtrerare involverar antingen inkubation (indirekta tekniker) eller samtidig insamling av omgivande och utandad vatten (direkta tekniker). Inkubationstider tekniker bygger på mätning av graden av förändring i koncentrationen av partiklar och lösta näringsämnen i det inkuberade vatten, och uppskatta produktionshastigheter eller avlägsnande jämfört med adekvata kontroller ^8. Däremot kan innesluter en organism i en inkubation kammare ändra sitt inmatningszong och pumpa beteende på grund av förändringar i det naturliga systemet flödet, på grund av en nedgång i syre och / eller i livsmedel koncentration, eller på grund av ansamling av utsöndring föreningar i inkubation vatten ^7,9 (och referenser däri). Förutom effekterna av instängdhet och ändrat vattenförsörjning, en större förspänning inkubation teknik härrör från re-filtreringseffekter (se t ex ^10). Även om vissa av dessa metodologiska problem har övervunnits genom att använda rätt volym och form av inkubationskärlet ¹¹ eller med införandet av en återcirkulerande klock behållarsystemet in situ ^12, underskattar denna teknik ofta borttagning och produktionshastigheter. Kvantifiering av metabolismen av upplösta föreningar såsom löst organiskt kväve (DON) och kol (DOC) eller oorganiska näringsämnen, har visat sig vara särskilt benägna att skevheter orsakade av inkubationstider tekniker ^13.

I slutet av 60-talet och början av 70-talet, Henry Reiswig^9,14,15 banat väg för tillämpning av direkta metoder för att kvantifiera partikelavlägsnande av gigantiska karibiska svampar, genom separat sampling vattnet inandas och utandas av organismerna på plats. På grund av svårigheten att tillämpa Reiswig teknik på mindre suspensionsätare och mer utmanande vattens förhållanden, var den största delen av forskningen på detta område begränsas till laboratoriet (in vitro) sysselsätter mestadels indirekt inkubation tekniker ^16. Yahel och kollegor byggs Reiswig direkta in situ teknik för att arbeta i mindre skala förhållanden. Deras metod, benämnd inex ^16, är baserad på samtidig vattens provtagning av vattnet inhaleras (In) och utandad (Ex) genom ostörda organismer. De olika koncentration av ett ämne (t.ex. bakterier) mellan ett par av prover (Inex) ger ett mått på retention (eller produktion) av ämnet av djuret. Inex teknik använder öppna ändar rör ochförlitar sig på excurrent stråle som åstadkoms av pump aktiviteten hos den studerade organismen att passivt ersätta det omgivande vattnet i uppsamlingsröret. Medan Yahel och kollegor har framgångsrikt tillämpat denna teknik i studien med över 15 olika suspensionsätare taxa (t.ex. ^17), är den metod som begränsas av den höga nivån av praxis och erfarenhet som krävs, genom minimala storleken på vissa excurrent öppningar, och sjöförhållanden.

För att övervinna dessa hinder, vi utvecklat en alternativ teknik baserad på kontrollerad sugning av den samplade vatten genom minut rör (ytterdiameter <1,6 mm). Vårt mål var att skapa en enkel, tillförlitlig och billig anordning som skulle tillåta ren och kontrollerad in situ vattenprovtagning från en mycket specifik punkt, t.ex. excurrent öppning av botten suspensionsätare. För att vara effektiv, har metoden att vara icke störande att inte påverka regimen omgivande flödet eller modifiera behavior av de studerade organismer. Anordningen som presenteras här kallas VacuSIP. Det är en förenkling av SIP-systemet som utvecklats av Yahel et al. (2007) ¹⁸ för ROV-baserad punkt provtagning i det djupa havet. Den VacuSIP är betydligt billigare än den ursprungliga SIP och det har anpassats för SCUBA baserat arbete. Systemet har utformats i enlighet med principer som presenteras och testas av Wright och Stephens (1978) ¹⁹ och Møhlenberg och Riisgård (1978) ²⁰ för laboratoriemiljö.

Även om VacuSIP systemet utformades för in situ studier av metabolismen av botten suspensionsätare kan det också användas för laboratoriestudier och varhelst det krävs en kontrollerad och ren, punktkälla vattenprov. Systemet är särskilt användbart när integrationen över långa perioder (min-timmar) eller in situ filtreringar krävs. Den VacuSIP har använts framgångsrikt vid Yahel labbet sedan 2011, och har ävenanvänts i två nya studier av näringsflöden förmedlade av Karibien och Medelhavet svamp arter ²¹ (Morganti et al. submitted).

Användningen av specifika provtagare, den förlängda provtagningstiden, och fältförhållanden, där VacuSIP tillämpas, medföra vissa avvikelser från standardoceanografiska protokoll för att samla in, filtrera och lagra prover för känsliga analyter. För att minska risken för kontamination av VacuSIP systemet eller risk för modifiering av den samplade vatten genom bakteriell aktivitet efter insamling, testade vi olika in situ filtrering och lagringsförfaranden. Olika filteranordningar, uppsamlingskärl och lagring förfaranden undersöktes i syfte att uppnå den mest lämpliga tekniken för analys av löst oorganiskt (PO ₄ ^3-, _NOx ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ och den organiska (DOC + DON) föreningar, och ultra-plankton (<1081; m) och partikulärt organiskt (POC + PON) provtagning. För att ytterligare minska risken för kontaminering, särskilt under fältmässiga förhållanden, har antalet hanteringssteg reduceras till ett minimum. Den visuellt format, i vilket förfarandet presenteras är orienterad för att underlätta reproducerbarheten och minska den tid som krävs för att effektivt tillämpa den tekniken.

System översikt

Att sampla in situ pumpas vatten från suspensionsätare med exhalant öppningar så små som 2 mm, är pump aktiviteten hos varje prov först visualiseras genom att släppa filtrerat fluorescein färgade havsvatten bredvid inhalant öppning (s) och observera dess flöde från excurrent öppningen ¹⁶ (se även figur 2B i ^18). Vattnet inandas och utandas av studieprov (incurrent och excurrent) är sedan samtidigt samplas med användning av ett par av minimala rören installerade på specialbyggd manipulator eller på två av de "arms "av en upp-och-ned flexibel bärbar stativ (Figur 1 och tilläggs Video 1). Vattnet inandas av försöksorganismen samlas genom att försiktigt placera den proximala änden av ett rör inuti eller i närheten av inhalant öppning av studien organismen. En identisk röret placeras sedan inuti excurrent öppningen. Denna åtgärd kräver god omsorg för att undvika kontakt eller störning av djur, till exempel genom att sediment resuspension. för att börja provtagning genomborrar en dykare en skiljevägg i uppsamlingskärlet med en sprutnål fäst vid distala änden av varje rör, vilket gör att den externa vattentrycket att tvinga den samplade vatten in i kärlet genom provtagningsröret. suget initieras av vakuumet som skapats tidigare i ampullerna och av tryckskillnaden mellan den externa vatten och den evakuerade provbehållaren .

För att säkerställa en ren samling av utandad vatten och för att undvika oavsiktlig uppsugning av ambient vatten ^16, behöver vatten samplingshastigheten hållas på en betydligt lägre hastighet (<10%) än excurrent flödet. Suganhastigheten regleras genom längden av röret och dess innerdiameter (ID). Den lilla innerdiameter ger också en försumbar död volym (<200 ^ per meter slang). Provtagning under långa perioder (minuter till timmar) gör det möjligt att integrera den inneboende flammighet de flesta ämnen av intresse. För att säkerställa att proven är tillräckligt bevaras i långa undervattens provtagningarna samt för transport till laboratoriet, en in situ filtrering rekommenderas för känsliga analyter. Valet av provtagningskärl, filtreringsanordningen, och slangar dikteras av studie organismer och den specifika frågeställningen. Protokollet som beskrivs nedan förutsätter att en fullständig metabolisk profil är av intresse (för en översikt se figur 2). Emellertid tillåter f modul karaktär av protokolleteller lätt modifiering för att rymma enklare eller till och med mycket olika system för provtagning. För en fullständig metabolisk profil, bör provtagningsprotokoll omfatta följande steg: (1) Flödes visualisering; (2) Provtagning ultra plankton utfodring (plankton <10 um); (3) Provtagning oorganiska näringsämnen upptag och utsöndring (med in-line filter); (4) Provtagning löst organiskt upptag och utsöndring (med in-line filter); (5) Partikel utfodring och utsöndring (med in-line filter); (6) Upprepa steg 2 (ultra-plankton utfodring som kvalitetskontroll); (7) Flödes visualisering.

När logistiskt möjligt, rekommenderas att de metaboliska profilmätningar kombineras med pumphastighet (t.ex. färgfronten hastighetsmetoden, ¹⁶⁾ samt med respirationsmätningar. Dessa mätningar är bäst tas i början och slutet av provtagning. För andning mätning vattens optodes eller mikroelektroder är att föredra.

Protocol

1. förberedande åtgärder och rengöringsmetoder tvättlösning Bär skyddsutrustning, en labbrock och handskar vid alla tidpunkter. Utföra dessa förberedande steg i en ren plats fri från damm och rök. Bered en 5-10% -ig saltsyra (HCl) -lösning med färsk, hög kvalitet, dubbeldestillerat vatten. Bered en 5% mycket löslig basisk blandning av anjoniska och icke-joniska lösningen ytaktivt medel (se Material List) med färskt, hög kvalitet, dubbeldes…

Representative Results

Optimering av havsvatteninsamlingsmetoder Val av samlar flaskor och rengöring VacuSIP-kompatibla uppsamlingskärl bör ha en skiljevägg som tillåter provtagning ska inledas genom att sticka hål med en sprutnål. De bör motstå förhöjda vattens tryck (2-3 bar vid typiska scuba arbetsdjup), och bör hålla ett vakuum. …

Discussion

förberedande steg

Samlare flaskor för DOM och näringsämnesanalyser

Eftersom samlare fartyg kan interagera med lösta mikrokomponenter och provtagaren väggarna kan vara ett substrat för bakterietillväxt ^30-34 olika flaskor för DOM och närings samling testades. Borsilikat rekommenderas inte för kiseldioxid kvantifiering ^33,35, eftersom glasflaskor kan öka den initiala koncentrationen av kis…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181