Observation och kvantifiering av Telomer och repetitiva sekvenser användning av fluorescens<em> In Situ</em> Hybridisering (FISH) med PNA prober<em> Caenorhabditis elegans</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Telomer skyddar kromosomändarna från avvikande fusion och nedbrytning. Däggdjur telomer består av G-rika hexamera upprepningar, TTAGGG och shelterin komplex. Telomeren upprepningssekvens av nematoden är liknande dem i däggdjur (TTAGGC). De flesta eukaryoter använder telomeras för att lägga till telomeren upprepar sina kromosomändarna. Men 10-15% av cancerceller utnyttjar telomeras oberoende mekanism, känd som alternativ Förlängning av Telomerer (ALT) ^3. Tidigare rapporterade vi att telomeren upprepar och dess tillhörande sekvenser, namnges som tält, amplifierades i telomererna av telomeras muterade linjer som överlevde kritisk sterilitet ^2.

Telomerlängd mättes genom kvantitativ PCR eller Southern blöt, vilket ger genomsnittliga längden av den totala telomerer ^4,5,6,7. Läs räkning av telomer upprepa i hela genomet sekvenseringsdata är också en indikator på den totala telomeren innehåll ^8. Även om SinGLE telomerlängd Analysis (STELA) skulle kunna ge längden på en enda telomer, kan det inte ge rumslig information om telomerer ^9. Medan POT-1 :: mCherry reporterprotein ger den rumsliga information av telomerer in vivo, kan den inte representera längder av dubbelsträngade telomerer, som POT-1 är ett enkelsträngat telomer-bindande protein ^10.

Medan ovannämnda metoder ger i genomsnitt information repetitiva sekvenser, fluorescens in situ hybridisering (FISH) gör det möjligt att observera mängden och rumsliga mönster av enskilda sekvenser av intresse på en kromosom skala. Istället för rening av DNA, är vävnader eller celler fast att bevara den naturliga geografisk information i fisk. Således är FISH en både kvantitativ och kvalitativ verktyg för observation av enskilda upprepade sekvenser, såsom telomeren upprepas.

Detta protokoll ger en effektiv metod för samtidig detektion av både telobara och andra upprepningar baserad på förbättringar från tidigare beskrivna metoder ^11,12. C. elegans larver eller vuxna är flercellig organism med högt differentierade celler. Heterogenitet celler hindrar på kvantitativ analys av ett stort antal telomeren fläckar. För att maximera antalet celler som analyserats, embryon isoleras och sprids på polylysin-belagda objektglas för fisk. Dessutom kan detta protokoll också kombineras med immunofluorescens.

Som ett bevis på att protokollet fungerar, visar vi att det är möjligt att observera och kvantifiera två olika repetitiva sekvenser. DNA-sond mot TALT1 genererades med enkel PCR införliva digoxigenin-dUTP. Då denna TALT1 sond och fluorescensmärkt telomer PNA prob hybridiserades samtidigt. Därefter digoxigenin detekteras genom kanoniska immunofluorescens metoder. Vi presenterar här de representativa bilder där TALT1 samlokaliserades med telomeren i TRT-1 </em> överlevande.

Protocol

1. Märkning Prober med digoxigenin-dUTP genom PCR Utför PCR märkning med 10x dNTP-blandning innehållande digoxigenin-dUTP som tidigare beskrivits 13. Rena PCR-produkten med spinnkolonnrening enligt tillverkarens anvisningar. Om sonden är kortare än 200 bp, avlägsna fritt digoxigenin-dUTP med spin-kolonnkromatografi från reaktionsblandningen snarare än spin-reningskolonn. 2. förbereda Polylysin Belagda Slides Notera: Hel…

Representative Results

Det har tidigare rapporterats att ALT överlevande kan ta sig ur telomeras-mutant, TRT-1 (ok410), i låg frekvens genom att replikera internt lokaliserad "mall av ALT" (tält) sekvenser för telomer underhåll 2. Med hjälp av PNA-sond, kunde vi visualisera telomerer i dissekerade könskörtlarna (figur 2A). Den svaga telomeren signal detekterades både i TRT-1 (ok410) och ALT överlevande. Den statistiska signalen lappade endast me…

Discussion

Den största fördelen med våra protokoll är enkelheten i förfarandet utan märkbar skada på morfologin hos cellstrukturen. Flera steg optimerades för C. elegans FISH i detta protokoll. De kritiska steg för framgångsrik FISH inkluderar märkning av prober, fixering av embryon och penetration. Digoxigenin-dUTP märkningsmetod ger en enkel att använda märkningsmetod genom PCR eller nick-translation. Att märka lång målsekvens är nick-translation föredra. I detta fall bör sondema spjälkas med lämpl…

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502