Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em> In Situ</em> Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em> Caenorhabditis elegans</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Telomeer beschermt chromosomale uiteinden van afwijkende fusion en degradatie. Zoogdieren telomeer is samengesteld uit G-rijke hexamere herhalingen, TTAGGG en shelterin complexen. De telomere repeat sequentie van de nematode is vergelijkbaar met die van zoogdieren (TTAGGC). De meeste eukaryoten gebruik maken van telomerase aan telomeer herhalingen toe te voegen aan hun chromosomale uiteinden. Echter, 10-15% van kankercellen gebruik telomerase onafhankelijk mechanisme, bekend als alternatieve Verlenging van Telomeren (ALT) ^3. Eerder hebben we gemeld dat telomeer herhalingen en de bijbehorende sequenties, genoemd als Talt, werden versterkt in de telomeren van telomerase mutant lijnen die kritische steriliteit ² overleefd.

Telomeerlengte werd gemeten door middel van kwantitatieve PCR of Southern blot, dat de gemiddelde lengte van telomeren totale ^4,5,6,7 biedt. Lees telling van telomeer repeat in whole genome sequencing data is ook een indicator van de totale inhoud van telomeren ^8. Hoewel Single telomeerlengte Analyse (STELA) kan over een lengte van een telomeer, kan geen ruimtelijke informatie telomeren ⁹ verschaffen. Terwijl POT-1 :: mCherry reportergen bevat de ruimtelijke informatie van telomeren in vivo, kan niet stukken dubbelstrengs telomeren vertegenwoordigen als POT-1 is een enkelstrengs telomeer eiwit ^10.

Terwijl genoemde werkwijzen de gemiddelde informatie van repetitieve sequenties, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) maakt het mogelijk om de hoeveelheid en ruimtelijke patroon van afzonderlijke sequenties van belang mbt een chromosomaal gebied. In plaats van zuivering van DNA, weefsels of cellen gefixeerd met de natuurlijke ruimtelijke informatie in FISH behouden. Zo FISH is een zowel kwantitatieve als kwalitatieve tool voor het observeren van de individuele herhaalde sequenties, zoals telomeer herhalingen.

Dit protocol verschaft een efficiënte werkwijze voor het gelijktijdig detecteren van zowel telolouter en andere repeats gebaseerd op verbeteringen van eerder beschreven methoden ^11,12. C. elegans larven of volwassenen zijn meercellig organisme met zeer gedifferentieerde cellen. De heterogeniteit van cellen belemmert op de kwantitatieve analyse van een groot aantal telomere spots. Om het aantal geanalyseerde cellen te maximaliseren, embryo geïsoleerd en uitgespreid op de-polylysine gecoate glaasjes voor FISH. Bovendien kan dit protocol ook worden gecombineerd met immunofluorescentie.

Als bewijs dat het protocol werkt, wordt aangetoond dat het mogelijk is om te observeren en te kwantificeren twee verschillende repetitieve sequenties. DNA-probe tegen TALT1 werd gegenereerd met PCR eenvoudige integratie digoxigenine-dUTP. Dan is deze TALT1 probe en fluorescentie-gemerkte telomere PNA probe werden gelijktijdig gehybridiseerd. Vervolgens werd digoxigenine gedetecteerd door immunofluorescentie canonieke werkwijzen. Wij presenteren hier de vertegenwoordiger van de beelden, waar TALT1 colocalized met de telomeer in TRT-1 </em> overlevenden.

Protocol

1. Labeling Probes met digoxigenine-dUTP door PCR Voer PCR labeling met 10x dNTP mengsel dat digoxigenine-dUTP zoals eerder beschreven 13. Zuiver PCR product met spin kolomzuivering volgens de instructies van de fabrikant. Als de probe korter dan 200 bp, verwijdert vrije digoxigenine-dUTP spin-kolomchromatografie uit het reactiemengsel plaats van spin-kolomzuivering. 2. Voorbereiden polylysine gecoate glaasjes Opmerking: De gehel…

Representative Results

Eerder werd gemeld dat de ALT overlevende kan ontstaan ​​uit telomerase-deficiënte mutant, TRT-1 (ok410), in een lage frequentie door het repliceren van intern gelokaliseerde 'Template van ALT' (Talt) sequenties voor telomeren onderhoud 2. Gebruik PNA probe, konden we telomeren in ontleed geslachtsklieren (Figuur 2A) te visualiseren. De zwakke telomeer signaal werd waargenomen zowel in TRT-1 (ok410) en ALT overlevende. De fuzzy s…

Discussion

Het belangrijkste voordeel van ons protocol is de eenvoud van de procedure zonder merkbare schade aan de morfologie van celstructuur. Verschillende stappen werden geoptimaliseerd voor C. elegans FISH in dit protocol. De kritische stappen voor een succesvolle vissen omvatten etikettering van probes, fixatie van embryo's en penetratie. Digoxigenine-dUTP labeling methode biedt een eenvoudig te gebruiken methode labeling met behulp van PCR of nick-translatie. Om lange doelsequentie te labelen, is nick-translati…

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502