Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence<em> In Situ</em> Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en<em> Caenorhabditis elegans</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Télomères protège les extrémités chromosomiques de fusion aberrante et la dégradation. télomères mammalien se compose de séquences répétées riches en G hexamérique, TTAGGG et les complexes shelterin. La séquence répétée télomérique du nématode est similaire à ceux des mammifères (TTAGGC). La plupart des eucaryotes utilisent télomérase pour ajouter des répétitions télomériques à leurs extrémités chromosomiques. Cependant, 10 – 15% des cellules cancéreuses utilisent télomérase mécanisme indépendant, connu sous le nom alternatif Allongement de télomères (ALT) ^3. Auparavant, nous avons signalé que les répétitions des télomères et ses séquences associées, nommées comme TALT, ont été amplifiés dans les télomères des lignées mutantes télomérase qui ont survécu à la stérilité critique ^2.

La longueur des télomères a été mesurée par PCR quantitative ou par transfert de Southern, qui fournit la longueur moyenne des télomères totaux ^4,5,6,7. Lire le nombre de répétition des télomères dans les données ensemble de séquençage du génome est également un indicateur de contenu total des télomères ^8. Bien que Single télomères Longueur Analyse (STELA) pourrait fournir la longueur d'un seul télomères, il ne peut pas fournir l' information spatiale des télomères ^9. Alors que POT-1 :: mCherry protéine rapporteur fournit l'information spatiale des télomères in vivo, il ne peut pas représenter la longueur de télomères double brin, comme POT-1 est une protéine ¹⁰ de liaison d' un seul brin télomère.

Bien que les méthodes mentionnées ci – dessus fournissent les informations moyenne de séquences répétitives, la fluorescence dans l' hybridation in situ (FISH) permet d'observer la quantité et la répartition spatiale des séquences individuelles d'intérêt sur ​​une échelle chromosomique. Au lieu de la purification de l'ADN, les tissus ou les cellules sont fixées pour préserver les informations spatiales natif dans le poisson. Ainsi, FISH est un outil à la fois quantitative et qualitative pour l'observation de séquences répétées individuelles, telles que les répétitions des télomères.

Ce protocole fournit un procédé efficace pour la détection simultanée des deux télosimples et d' autres répétitions basées sur des améliorations de méthodes ^11,12 décrites précédemment. C. elegans larves ou adultes sont organisme multicellulaire avec des cellules hautement différenciées. L'hétérogénéité des cellules empêche l'analyse quantitative d'un grand nombre de taches de télomères. Afin de maximiser le nombre de cellules analysées, les embryons sont isolés et se propager sur les lames de polylysine revêtues pour FISH. Par ailleurs, ce protocole peut aussi être combiné avec immunofluorescence.

Comme preuve que le protocole fonctionne, nous montrons qu'il est possible d'observer et de quantifier deux séquences répétitives différentes. sonde d'ADN contre TALT1 a été généré par PCR simple contenant digoxigénine-dUTP. Ensuite, cette sonde TALT1 et télomères sonde PNA marqué par fluorescence ont été hybridées simultanément. Par la suite, la digoxigénine a été détectée par des méthodes d'immunofluorescence canoniques. Nous présentons ici les images représentatives où TALT1 colocalisés avec le télomère dans trt-1 </em> survivants.

Protocol

1. Sondes d'étiquetage avec digoxigénine-dUTP par PCR Effectuer l' étiquetage PCR 10x dNTP mix contenant digoxigénine-dUTP comme décrit précédemment 13. Purifier produit PCR avec purification spin-colonne selon les instructions du fabricant. Si la sonde est inférieure à 200 pb, retirer gratuitement digoxigénine-dUTP par chromatographie spin-colonne à partir du mélange de réaction plutôt que la purification spin-colonne. <p class="jove_tit…

Representative Results

Il a été précédemment rapporté que survivant ALT peut émerger de mutant télomérase déficient, trt-1 (ok410), en basse fréquence en répliquant localisée en interne "Modèle d'ALT '(TALT) séquences pour télomères entretien 2. En utilisant la sonde PNA, nous avons été en mesure de visualiser les télomères dans les gonades disséquées (figure 2A). Le signal de télomères faible a été détectée à la fois dans trt-1…

Discussion

Le principal avantage de notre protocole est la simplicité de la procédure sans dommage sensible à la morphologie de la structure cellulaire. Plusieurs étapes ont été optimisés pour C. elegans FISH dans ce protocole. Les étapes essentielles pour FISH succès comprennent l'étiquetage des sondes, la fixation des embryons et la pénétration. méthode de marquage digoxigénine-dUTP fournit une méthode d'étiquetage facile à utiliser par PCR ou pseudo-traduction. Pour marquer la séquence cible ?…

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502