Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em> In Situ</em> Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em> Caenorhabditis elegans</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Telomere schützt Chromosomenenden von anomalen Fusion und Abbau. Mammalian Telomer besteht aus G-reichen hexameren wiederholt, TTAGGG und Shelterin Komplexe. Die telomere Wiederholungssequenz des Nematoden ist ähnlich zu denen von Säugetieren (TTAGGC). Die meisten Eukaryoten nutzen Telomerase Telomerwiederholungen zu ihrer chromosomalen Enden hinzufügen. Allerdings, 10 – 15% der Krebszellen nutzen Telomerase unabhängigen Mechanismus, bekannt als Alternative Verlängerung von Telomeren (ALT) ^3. Zuvor berichteten wir , dass Telomerwiederholungen und die damit verbundenen Folgen, wie TALT genannt, in den Telomeren der Telomerase Mutantenlinien verstärkt wurden , die ^zwei kritische Sterilität überlebt.

Telomerlänge wurde durch quantitative PCR oder durch Southern – Blot gemessen, die ^4,5,6,7 durchschnittliche Länge von insgesamt Telomere zur Verfügung stellt. Lesen Anzahl der Telomer – Repeat in Genomsequenzierungsdaten ist auch ein Indikator für insgesamt Telomer Inhalt ^8. Obwohl Single Telomerlänge Analysis (STELA) könnte die Länge eines einzelnen Telomere liefern, es ⁹ räumliche Informationen der Telomere nicht zur Verfügung stellen kann. Während POT-1 :: mCherry Reporterprotein die räumliche Information der Telomere in vivo liefert, kann sie nicht Längen von doppelsträngigen Telomere darstellen, als POT-1 ein Einzelstrang ist Telomer – bindendes Protein ^10.

Während zuvor genannten Verfahren der gemittelten Daten von repetitiven Sequenzen bereitzustellen, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht , die Menge und räumlichen Muster von individuellen Sequenzen von Interesse auf einer chromosomalen Skala zu beobachten. Anstelle der Reinigung von DNA werden Gewebe oder Zellen fixiert die native räumliche Informationen in FISH zu bewahren. Somit ist FISH eine sowohl quantitative als auch qualitative Werkzeug zur Beobachtung der einzelnen Wiederholungssequenzen, wie beispielsweise Telomerwiederholungen.

Dieses Protokoll liefert ein effizientes Verfahren zur gleichzeitigen Nachweis beider teloC. bloße und andere Wiederholungen von zuvor beschriebenen Methoden ^11,12 auf Verbesserungen basieren. elegans Larven oder Erwachsene sind vielzelligen Organismus mit hoch differenzierten Zellen. Die Heterogenität von Zellen hemmt auf die quantitative Analyse einer großen Anzahl von Telomer Flecken. Um die Anzahl der analysierten Zellen zu maximieren, Embryonen isoliert und verteilt auf die Polylysin-beschichteten Objektträger für die Fische. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch mit Immunofluoreszenz kombiniert werden.

Als Beweis dafür, dass das Protokoll funktioniert, zeigen wir, dass es möglich ist, zwei unterschiedliche repetitive Sequenzen zu beobachten und zu quantifizieren. DNA-Sonde gegen TALT1 wurde erzeugt mit einfachen PCR-Digoxigenin-dUTP enthält. Dann ist diese TALT1 Sonde und Fluoreszenz-markierten Telomere PNA-Sonde wurden gleichzeitig hybridisiert. Anschließend wurde Digoxigenin durch kanonische Immunofluoreszenz Methoden nachgewiesen. Wir stellen Ihnen hier die repräsentativen Bilder , in denen TALT1 mit der Telomere in trt-1 kolokalisiert </em> Überlebenden.

Protocol

1. Markierung von Sonden mit Digoxigenin-dUTP durch PCR Führen Sie die PCR – Markierung mit 10x dNTP – Mix enthält Digoxigenin-dUTP wie zuvor 13 beschrieben. Reinige PCR-Produkt mit Spin-Säulenreinigung nach Herstelleranleitung. Wenn die Sonde kürzer als 200 bp ist, entfernen freie Digoxigenin-dUTP mit Spin-Säulenchromatographie aus der Reaktionsmischung statt Spin-Säulenreinigung. 2. Vorbereitung Polylysin beschichteten Objektträ…

Representative Results

Es wurde bereits berichtet , dass ALT Überlebende von Telomerase-defiziente Mutante entstehen kann, trt-1 (ok410), in niedriger Frequenz durch Replizieren intern lokalisierte 'Vorlage von ALT (TALT) Sequenzen für Telomererhaltung 2. Mit PNA – Sonde konnten wir Telomere in den sezierten Gonaden (2A) zu visualisieren. Das schwache Telomer – Signal wurde sowohl in trt-1 (ok410) und ALT Überlebende entdeckt. Die Fuzzy-Signal wurde überlap…

Discussion

Der Hauptvorteil unserer Protokolls ist die Einfachheit des Verfahrens ohne nennenswerte Beschädigung der Morphologie der Zellstruktur. Wurden mehrere Schritte für C optimiert elegans FISH in diesem Protokoll. Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche FISH umfassen Kennzeichnung von Sonden, die Fixierung von Embryonen und Penetration. Digoxigenin-dUTP Markierungsverfahren bietet eine einfach zu bedienende Markierungsverfahren durch PCR oder Nick-Translation. Zur Kennzeichnung wird lange Ziel…

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502