תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em> באתרו</em> הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).
Abstract
Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.
Introduction
הטלומרים מגן קצוות כרומוזומליות מן ההיתוך והשפלה סוטים. הטלומרים יונקים מורכב G-עשיר חזרות hexameric, TTAGGG, מתחמי shelterin. רצף חוזרים הטלומרים של נמטודות דומה לאלה של יונקים (TTAGGC). רוב אאוקריוטים לנצל טלומרז להוסיף חזרות הטלומרים למטרות כרומוזומליות שלהם. עם זאת, 10 – 15% של תאים סרטניים לנצל מנגנון עצמאי טלומרז, המכונה אלטרנטיבי הארכת הטלומרים (ALT) 3. בעבר, דיווחנו כי חזרות הטלומרים הרצפים הקשורים אליו, כפי ששמו tAlt, היו מוגברים הטלומרים של קווים מוטנטים טלומרז ששרדו עקרות 2 קריטיות.
אורך הטלומרים נמדד על ידי PCR כמוני או על ידי כתם דרום, מספק אורך ממוצע של הטלומרים הכוללים 4,5,6,7. ספירה קראו חוזרים הטלומרים בנתוני רצף הגנום כולו הוא גם אינדיקטור של תוכן הטלומרים הכולל 8. למרות החטאאורך הטלומרים GLE ניתוח (Stela) עשוי לספק אורך הטלומרים יחיד, זה לא יכול לספק מידע מרחבים של הטלומרים 9. בעוד POT-1 :: חלבון הכתב mCherry מספק את המידע המרחבי של הטלומרים in vivo, זה לא יכול לייצג אורכי הטלומרים פעמיים תקועים, כמו POT-1 הוא הטלומרים חד גדיל חלבון מחייב 10.
בעוד שיטות הנ"ל לספק את המידע הממוצע של רצפים חוזרים, קרינת הכלאה באתרו (FISH) מאפשרת להתבונן בכמויות ובדפוסים המרחבי של רצפים בודדים של עניין בסולם כרומוזומליות. במקום טיהור DNA, רקמות או תאים מקובעים לשמר את המידע המרחבי יליד בדגים. לפיכך, FISH הוא כלי כמותי ואיכותי הן לצורך השגחה של רצפים חוזרים הפרט, כגון חזרות הטלומרים.
פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה עבור זיהוי סימולטני של שני teloחזרות גרידא אחרות המבוססות על שיפורים מן השיטות שתוארו קודם לכן 11,12. ג זחלים או מבוגרים elegans הם אורגניזם רב-תאי עם תאים מובחנים מאוד. ההטרוגניות של תאים מעכבים על ניתוח כמותי של מספר רב של נקודות הטלומרים. כדי למקסם את מספר התאים נתחו, עובר מבודדים להפיץ בשקופיות מצופות polylysine לדגים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול גם להיות משולב עם immunofluorescence.
כהוכחה כי הפרוטוקול עובד, אנו מראים כי אפשר לצפות ולכמת שני רצפים חוזרים שונים. בדיקת DNA נגד TALT1 נוצרה עם PCR פשוט שילוב digoxigenin-dUTP. ואז זה בדיקה TALT1 ו בדיקת PNA הטלומרים שכותרתו קרינה היו הכלאה זמנית. בהמשך לכך, digoxigenin זוהה על ידי שיטות immunofluorescence הקנונית. אנו מציגים כאן את התמונות נציג שבו TALT1 colocalized עם הטלומרים ב TRT-1 </em> ניצולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרון העיקרי של פרוטוקול שלנו הוא הפשטות של ההליך ללא נזק בולט את המורפולוגיה של המבנה התאי. צעדים אחדים היו אופטימיזציה עבור ג elegans FISH בפרוטוקול זה. השלבים הקריטיים לדגים מוצלחים כוללים תיוג של בדיקות, קיבעון של עוברים וחדירים. שיטת תיוג Digoxigenin-dUTP מספקת שיטת תי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).
Materials
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2X SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10X PBS | For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01 % w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20X SSC | To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1 % tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Equipments | |||
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens. |
| Dry block / aluminum block | Labtech | LBH-T03 | Set temperature to 80℃ |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, 14 (2001).
