Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan<em> In Situ</emPNA Sondalar> ile hibridizasyon (FISH)<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).
Abstract
Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.
Introduction
Telomer olarak anormal füzyon ve bozulma kromozomal uçları korur. Memeli telomer G bakımından zengin heksamerik tekrarlar, TTAGGG ve shelterin kompleksleri oluşur. nematodun telomer tekrar dizisi memelilerde (TTAGGC) benzer olan. Çoğu ökaryotlar kendi kromozom uçları telomer tekrarlar eklemek için telomeraz kullanmaktadır. Ancak, 10 – kanser hücrelerinin% 15 Telomerlerin (ALT) 3 Alternatif uzatma olarak bilinen telomeraz bağımsız bir mekanizma kullanmaktadır. Daha önce, telomer tekrarlar ve tAlt olarak adlandırılan ilişkili diziler, kritik sterilite 2 hayatta telomeraz mutant soylarının telomerlerin amplifiye bildirmiştir.
Telomer uzunluğu kantitatif PCR veya toplam telomerlerin 4,5,6,7 ortalama uzunluğu içerir Southern blot ile ölçülmüştür. Tüm genom dizileme verileri telomer tekrarın Oku sayısı da toplam telomer içeriğinin 8 bir göstergesidir. Sin rağmengle telomer uzunluğunun Analizi (STELA) tek bir telomer uzunluğu, bu telomerlerin 9 mekansal bilgi sağlayamaz sağlayabilir. POT-1 :: MCherry muhabiri protein in vivo telomerlerin mekansal bilgi sağlarken POT-1 proteini 10 bağlayıcı tek iplikli telomer olduğu gibi, bu çift sarmallı telomer uzunluklarını temsil edemez.
Yukarıda bahsedilen yöntemler dizilerin ortalama bilgi sağlar birlikte, in situ hibridizasyon (FISH) floresan kromozomal ölçekte miktarı ve ilgi duyulan tek tek dizilerin uzamsal desen gözlemlenebilir. Bunun yerine DNA saflaştırma, doku ya da hücre FISH nativ uzamsal bilgiler korumak için sabitlenir. Böylece, BALIK gibi telomer tekrarlar gibi bireysel tekrar dizilerinin, gözlem için bir nicel ve nitel bir araçtır.
Bu protokol, hem Telo eş zamanlı saptanması için etkili bir yöntem sağlarsadece ve diğer tekrarlar daha önce açıklanan yöntemlerden 11,12 den iyileştirmeler dayalı. C. elegans larvaları veya yetişkin yüksek farklılaşmış hücreler ile çok hücreli organizma bulunmaktadır. hücrelerin heterojen telomer noktalar sayıda kantitatif analizi engellemektedir. analiz hücrelerin sayısını arttırmak için, embriyolar izole ve FISH için polilisin ile kaplanmış dilimlerin üzerine yayılırlar. Buna ek olarak, bu protokol, aynı zamanda, bağışıklık ile kombine edilebilir.
protokol çalışan bir kanıtı olarak, biz gözlemlemek ve iki farklı tekrarlayan dizileri ölçmek mümkün olduğunu göstermektedir. TALT1 karşı DNA probu basit PCR digoksijenin-dUTP birleşmeyle ile üretilmiştir. Daha sonra, bu TALT1 probu ve floresan işaretli telomer PNA probu aynı zamanda hibridize edildi. Daha sonra, digoksigenin kanonik immünofloresan yöntem ile tespit edilmiştir. Biz burada TALT1 TRT-1'de telomer ile kolokalize temsili görüntüler sunmak </em> kurtulanlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolde ana avantajı, hücresel yapının morfolojisine fark zarar vermeden prosedür basitliğidir. Birkaç adım C için optimize edildi Bu protokolde elegans BALIK. Başarılı FISH için kritik adımlar probların etiketleme, embriyo ve penetrasyon tespit sayılabilir. Digoksigenin dUTP etiketleme yöntemi PCR ya da nik-çevirisi ile kolay kullanımlı etiketleme yöntemi temin etmektedir. Uzun hedef dizisi etiketlemek için, nick-çeviri tercih edilir. Bu durumda, sondalar sondaların sızmas?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).
Materials
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2X SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10X PBS | For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01 % w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20X SSC | To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1 % tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Equipments | |||
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens. |
| Dry block / aluminum block | Labtech | LBH-T03 | Set temperature to 80℃ |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, 14 (2001).
